Η Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση (ΠΓΔ) είναι μία εναλλακτική διαγνωστική προσέγγιση σε σχέση με την κλασσική προγεννητική διάγνωση που επιτρέπει τον έλεγχο μονογονιδιακών ή και χρωμοσωμικών διαταραχών σε δείγματα βιοψίας από έμβρυα εξωσωματικής γονιμοποίησης (IVF), με σκοπό τη μεταφορά στη μήτρα μόνο των υγιών εμβρύων. Ένδειξη για ΠΓΔ είναι τα μονογονιδιακά νοσήματα με γνωστή μοριακή βάση, όπως η αχονδροπλασία, που αποτελεί τη συχνότερη αιτία νανισμού στον άνθρωπο, με συχνότητα στον πληθυσμό 1:15.000-25.000. Πρόκειται για ένα αυτοσωμικό επικρατητικό νόσημα με πλήρη διεισδυτικότητα. Η πλειοψηφία των ασθενών φέρει σε μοριακό επίπεδο τη σημειακή μεταλλαγή c.1138G>A στο εξώνιο 10 στο γονίδιο του υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών 3 (FGFR3).
Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη και βελτιστοποίηση ενός πρωτοκόλλου ΠΓΔ για αχονδροπλασία, σύμφωνα με τις προδιαγραφές που θέτει η Ευρωπαϊκή Εταιρία Ανθρώπινης Αναπαραγωγής και Εμβρυολογίας (ESHRE), για ένα ζευγάρι που απευθύνθηκε στο εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής του Πανεπιστημίου Αθηνών. Η υποψήφια μητέρα φέρει σε ετερόζυγη μορφή τη μεταλλαγή c.1138G>A του γονιδίου FGFR3, η οποία εμφανίζεται «de-novo», ενώ ο σύζυγος της είναι φυσιολογικός. Στο αναπαραγωγικό ιστορικό του ζευγαριού καταγράφεται μία διακοπή κύησης μετά από προγεννητική διάγνωση ενός πάσχοντος εμβρύου. Δείγμα από το αμνιακό υγρό του προγεννητικού ελέγχου ήταν διαθέσιμο, υποστηρίζοντας την ανάπτυξη του πρωτοκόλλου ΠΓΔ.
Το πρωτόκολλο στοχεύει στην άμεση διάγνωση της παθογόνου μεταλλαγής c.1138G>A, με τη χρήση περιοριστικού ενζύμου σε συνδυασμό με έμμεση διάγνωση του νοσήματος σε βιοψίες εμβρύων, μέσω πληροφοριακών πολυμορφικών δεικτών-μικροδορυφορικών επαναλήψεων (STRs) που βρίσκονται σε γενετική σύνδεση με το γονίδιο FGFR3. Το πρωτόκολλο που αναπτύχθηκε στηρίζεται στην τεχνική της φθορίζουσας πολλαπλής PCR (Fluorescent multiplex-PCR). Για την ανάπτυξη του πρωτοκόλλου έγινε in silico αναζήτηση των STRs που βρίσκονται σε απόσταση μέχρι 1Mbp από το γονίδιο FGFR3. Κατόπιν, σχεδιάστηκαν εκκινητές της αντίδρασης πολλαπλής PCR για την ταυτόχρονη ενίσχυση της περιοχής της μεταλλαγής c.1138G>A και των STRs και παράλληλα επιλέχθηκε περιοριστικό ένζυμο που ανιχνεύει τη μεταλλαγή. Με ανάλυση γενετικής σύνδεσης στους υποψήφιους γονείς και στο πάσχον έμβρυο (linkage analysis), έπειτα από αντίδραση πολλαπλής PCR σε γενωμικό DNA των μελών της οικογένειας, διαπιστώθηκαν 3 πληροφοριακοί πολυμορφικοί δείκτες. Στη συνέχεια, το πρωτόκολλο βελτιστοποιήθηκε σε αραιωμένο γενωμικό DNA και σε μεμονωμένα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος της υποψήφιας μητέρας. Από την εκτίμηση της αξιοπιστίας και της ευαισθησίας του πρωτοκόλλου σε 38 μεμονωμένα λεμφοκύτταρα της υποψήφιας μητέρας και φυσιολογικού μάρτυρα, μέσω του υπολογισμού για κάθε γενετικό τόπο του ποσοστού επιτυχίας της PCR (≥95%) και του ποσοστού του μη ισοδύναμου πολλαπλασιασμού του DNA από τα δύο αλληλόμορφα (Allele drop-out, ADO) (≤8,3%), το πρωτόκολλο ΠΓΔ για αχονδροπλασία κρίθηκε κατάλληλο και αξιόπιστο για κλινική εφαρμογή σε επίπεδο DNA του ενός κυττάρου.
(EL)
Preimplantation genetic testing (PGΤ) is an alternative diagnostic method to classic prenatal diagnosis which tests embryo biopsies for inherited monogenic diseases or chromosomal abnormalities, by selecting only the unaffected embryos that derived from human assisted reproduction to be transferred to the mother’s uterus. Common PGT indications include monogenic diseases with known molecular basis. As such, achondroplasia is the most common form of dwarfism in humans, with a prevalence of 1:15.000-25.000. Achondroplasia is inherited as an autosomal dominant trait with complete penetrance and the vast majority of patients are heterozygous for the c.1138G>A point mutation in exon 10 of FGFR3 gene.
The aim of the present study is the development and optimization of a PGT protocol for achondroplasia, according to the European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE) PGT consortium guidelines, for a couple that approached the Laboratory of Medical Genetics of University of Athens. The affected mother carries a «de-novo» c.1138G>A mutation of the FGFR3 gene while her husband is unaffected. A selective abortion due to prenatal diagnosis of achondroplasia is recorded on couple’s reproductive history. Sample of the amniotic fluid was available, allowing the development of a PGΤ protocol for achondroplasia.
The protocol is based on fluorescent multiplex-PCR for direct and indirect detection of the FGFR3 pathogenic mutation (c.1138G>A), with restriction enzyme analysis and linked polymorphic markers-microsatellite repeats (STRs), respectively. Using in silico tools, we were able to identify the STRs that are linked to FGFR3 gene as well as to choose a restriction enzyme that facilitated detection of the c.1138G>A mutation. Following primers design, multiplex-PCR amplification reactions were performed on genomic DNA samples of each family member, in order to identify the informative STR markers in the family, through linkage analysis. The multiplex-PCR protocol was tested and optimized on diluted genomic DNA and subsequently peripheral blood single lymphocytes of the affected mother. After evaluating the PCR efficiency (≥95%) and Allele-drop out (ADO) (≤8,3%) on 38 single lymphocytes of the candidate mother and a negative control, the PGT protocol for achondroplasia was considered reliable and suitable for clinical application at a single-cell DNA level.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
