Η L-3,4 διυδροξυ-φαινυλ-αλανίνη αποκαρβοξυλάση (L-Dopa αποκαρβοξυλάση, L-Dopa
decarboxylase ή DDC, EC 4.1.1.26) είναι το ένζυμο το οποίο καταλύει την
αποκαρβοξυλίωση της L-Dopa σε ντοπαμίνη. Η ντοπαμίνη αποτελεί έναν από τους
σημαντικότερους διαμεσολαβητές της επικοινωνίας μεταξύ νευρικού και
ανοσοποιητικού συστήματος δεδομένου ότι αποτελεί ρυθμιστικό παράγοντα του
πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης διαφόρων υποτύπων λευκών αιμοσφαιρίων.
Τα λευκά αιμοσφαίρια αλληλεπιδρούν με την ντοπαμίνη όταν, μετά από ενεργοποίηση
τους, διαπερνούν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό, αλλά και στην περιφέρεια, καθώς
τα λευκά αιμοσφαίρια έχουν την ικανότητα ενδογενούς σύνθεσης, έκκρισης και
πρόσληψης των κατεχολαμινών. Η ντοπαμίνη ασκεί τη ρυθμιστική της δράση μέσω των
υποδοχέων ντοπαμίνης που εντοπίζονται στην πλασματική μεμβράνη των λευκών
αιμοσφαιρίων. Παρότι πολλαπλά πειραματικά δεδομένα υποδεικνύουν την επικοινωνία
μεταξύ νευρικού και ανοσοποιητικού συστήματος, το μονοπάτι βιοσύνθεσης
κατεχολαμινών στα λευκά αιμοσφαίρια, δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί. Επιπρόσθετα,
τα δεδομένα που αφορούν τη ρυθμιστική δράση της ντοπαμίνης παρουσιάζονται
αντιφατικά. Η ανάγκη να διερευνηθεί περαιτέρω η δράση της ντοπαμίνης στις
λειτουργίες του ανοσοποιητικού συστήματος ενισχύεται από δεδομένα σύμφωνα με τα
οποία μερικές από τις πιο σημαντικές νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η νόσος
του Parkinson και η σχιζοφρένεια έχουν συσχετιστεί με δυσλειτουργίες του
ανοσοποιητικού συστήματος. Συνεπώς, η πλήρης αποσαφήνιση των βιοχημικών
μονοπατιών στα οποία εμπλέκεται η ντοπαμίνη στο ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί να
βοηθήσει στην κατανόηση της παθογένεσης και στη θεραπεία πολλών
νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Βάσει των ανώτερων δεδομένων καθώς και πρόσφατων
μελετών στο εργαστήριο μας οι οποίες αποκάλυψαν για πρώτη φορά την έκφραση της
πλήρους μήκους DDC και του εναλλακτικού μεταγράφου από το οποίο απουσιάζει το
εξώνιο 3 σε ανθρώπινα περιφερικά λευκά αιμοσφαίρια, σκοπός της παρούσας
διατριβής ήταν η περαιτέρω διερεύνηση της έκφρασης, της υποκυτταρικής
κατανομής, της ενζυμικής ενεργότητας της DDC αλλά και της ρύθμισης της σε
κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος του ανθρώπου.
Τα αποτελέσματα της διατριβής συνοψίζονται στις παρακάτω τρείς ενότητες:
• Μελέτη έκφρασης, τοπολογίας και ενζυμικής ενεργότητας της DDC στα
ανθρώπινα περιφερικά λευκά αιμοσφαίρια
Με σκοπό τη μελέτη της υποκυτταρικής κατανομής της DDC στα ανθρώπινα περιφερικά
λευκά αιμοσφαίρια, δείγματα ομογενοποιήματος λευκών αιμοσφαιρίων επεξεργάστηκαν
με το μη ιονικό απορρυπαντικό Triton X-114. Το ένζυμο εντοπίστηκε τόσο στο
υδρόφιλο κλάσμα όσο και στο υδρόφοβο και ισχυρά υδρόφοβο ίζημα υποδηλώνοντας το
συσχετισμό του μορίου με το μεμβρανικό κλάσμα και την ύπαρξη πληθυσμών με
διαφορετικό βαθμό υδροφοβικότητας στα λευκά αιμοσφαίρια. Με πειράματα
ανοσοστύπωσης κατά Western ανιχνεύτηκε η εναλλακτική ισομορφή της DDC, alt-DDC.
Σε πειράματα μέτρησης ενεργότητας του ενζύμου σε ομογενοποίημα λευκών
αιμοσφαιρίων η DDC εμφανίζεται ενεργή ως προς την αποκαρβοξυλίωση της L-Dopa
(mU/mg = 3,67 ± 0,31). Αν και τα επίπεδα ενεργότητας της DDC στα λευκά
αιμοσφαίρια είναι χαμηλότερα σε σχέση με τα επίπεδα ενεργότητας της DDC νεφρού
ανθρώπου, τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η DDC των λευκών
αιμοσφαιρίων προέρχεται όχι μόνο μέσω πρόσληψης από το μεσοκυττάριο υγρό αλλά
και μέσω ενδογενούς σύνθεσης της στον κυτταρικό αυτό πληθυσμό.
• Μελέτη έκφρασης, τοπολογίας και ενζυμικής ενεργότητας της DDC στην
κυτταρική σειρά U937
Προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω η έκφραση, η τοπολογία και η ενζυμική
ενεργότητα της DDC στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, χρησιμοποιήθηκε η
κυτταρική σειρά U937. Πρόκειται για ανθρώπινα μονοκύτταρα προέλευσης μακροφάγων
τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως ως μοντέλο λειτουργίας μακροφάγων. Με
πειράματα ανοσοστύπωσης κατά Western, η DDC ανιχνεύεται για πρώτη φορά στην
κυτταρική σειρά U937. Διερεύνηση της φύσης των μεταγράφων που παράγονται στον
υπό μελέτη κυτταρικό τύπο με αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής-αλυσιδωτής
αντίδρασης πολυμεράσης και περαιτέρω πειράματα ανοσοστύπωσης κατά Western
υποδεικνύουν ότι στην κυτταρική σειρά U937 παράγονται η alt-DDC και το νευρικού
τύπου μετάγραφο από το οποίο απουσιάζει το εξώνιο 3. Το πλήρους μήκους
μετάγραφο, καθώς και μη νευρικού τύπου μετάγραφο δεν ανιχνεύονται. Η
υποκυτταρική κατανομή της DDC στην κυτταρική σειρά U937 διερευνήθηκε με τη
χρήση του αντιδραστηρίου Triton X-114. Η επεξεργασία των δειγμάτων με το μη
ιοντικό απορρυπαντικό είχε ως αποτέλεσμα την ανάκτηση της DDC στο υδρόφιλο,
υδρόφοβο, αλλά και στο ισχυρά υδρόφοβο κλάσμα, υποδεικνύοντας το συσχετισμό του
ενζύμου με τις μεμβράνες της κυτταρικής σειράς. Η DDC που συνδέεται με τις
μεμβράνες απελευθερώνεται στο υπερκείμενο με απλή επώαση. Η απελευθέρωση
φαίνεται να είναι pH εξαρτώμενη και οι βέλτιστες συνθήκες απελευθέρωσης
εμφανίζονται στο pH 6-6,5. Προσδιορισμός της ενεργότητας του ενζύμου σε ολικό
ομογενοποίημα, στο διαλυτό και στο μεμβρανικό κλάσμα των υπό μελέτη κυττάρων
υποδηλώνει ότι η DDC είναι ενζυμικά ενεργή ως προς την αποκαρβοξυλίωση της
L-Dopa σε ντοπαμίνη σε όλα τα υποκυτταρικά κλάσματα της κυτταρικής σειράς. Τα
επίπεδα ενζυμικής ενεργότητας του μορίου στο μεμβρανικό κλάσμα προσδιορίζονται
κατά 70% υψηλότερα σε σχέση τις τιμές ενεργότητας σε ολικό ομογενοποίημα και
στο διαλυτό κλάσμα της κυτταρικής σειράς U937. Η DDC που απελευθερώνεται από το
μεμβρανικό κλάσμα εμφανίζεται ενζυμικά ενεργή παρουσιάζοντας τη μέγιστη τιμή
ενεργότητας όταν η απελευθέρωση πραγματοποιείται σε pH 6-6,5. Επώαση σταθερής
ποσότητας πρωτεϊνών μεμβρανικού κλάσματος παρουσία αυξανόμενων ποσοτήτων ολικής
πρωτεΐνης διαλυτού κλάσματος είχε ως αποτέλεσμα την μείωση της ενζυμικής
ενεργότητας της DDC παρέχοντας ενδείξεις για την πιθανή ύπ
αρξη κάποιου ρυθμιστικού μορίου της ενζυμικής ενεργότητας της DDC στο διαλυτό
κλάσμα της κυτταρικής σειράς U937. Η εξωγενής χορήγηση του χημικού αναστολέα
της DDC, carbidopa, σε καλλιέργεια κυττάρων U937 για 24 ώρες οδηγεί σε
φαινόμενα κυτταροτοξικότητας κατά ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο υποδεικνύοντας ότι
η DDC μπορεί να εμπλέκεται σε μηχανισμούς επιβίωσης και κυτταρικού θανάτου των
κυττάρων του ανοσοβιολογικού συστήματος. Ομοίως, επώαση των κυττάρων U937
παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων ντοπαμίνης για 24 ώρες οδηγεί σε κυτταρικό
θάνατο. Τα αποτελέσματα αυτά ενισχύουν την υπόθεση ότι τα μακροφάγα είναι ικανά
να παραλαμβάνουν την εξωκυττάρια ντοπαμίνη η οποία ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό
και τον κυτταρικό θάνατο στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος.
• Απομόνωση και βιοχημικός χαρακτηρισμός ενός αναστολέα της ενζυμικής
ενεργότητας της DDC από την κυτταρική σειρά U937
Η ύπαρξη του αναστολέα της ενζυμικής ενεργότητας της DDC στην κυτταρική σειρά
U937 διαπιστώθηκε για πρώτη φορά μετά από επώαση δειγμάτων ομογενοποιήματος της
κυτταρικής σειράς U937 παρουσία ομογενοποιήματος κυττάρων ΗΕK-293 που ως
γνωστόν έχει υψηλά επίπεδα ενεργότητας L-Dopa αποκαρβοξυλάσης. Κλασμάτωση του
ομογενοποιήματος κυττάρων U937 είχε ως αποτέλεσμα την ανάκτηση της ανασταλτικής
ενεργότητας μόνο στο διαλυτό κλάσμα υποδηλώνοντας την υποκυτταρική τοπολογία
του αναστολέα. Περαιτέρω μελέτη μέσω θερμοεπαγώμενου διαχωρισμού φάσεων
παρουσία του μη-ιονικού απορρυπαντικού Triton X-114 οδήγησε σε ανάκτηση της
ανασταλτικής ενεργότητας στην υδατική φάση του Triton X-114, επιβεβαιώνοντας
την υδρόφιλη φύση του. Κατεργασία του διαλυτού κλάσματος των μακροφάγων (ΔΚΜ)
με τις πρωτεάσες σερίνης, θρυψίνη, χυμοθρυψίνη και πρωτεϊνάση Κ, είχε ως
συνέπεια την πλήρη απώλεια της ανασταλτικής του δράσης, υποδηλώνοντας την
πρωτεϊνική φύση του αναστολέα της ενζυμικής ενεργότητας της DDC. Η πρωτεϊνική
φύση του ρυθμιστικού μορίου επιβεβαιώθηκε μετά από μελέτη επίδρασης της
ριβονουκλεάσης Α στην ανασταλτική ενεργότητα του ΔΚΜ. Η ανασταλτική δράση του
ΔΚΜ επηρεάζεται από παραμέτρους, όπως ο χρόνος επώασης, το pH, η θερμοκρασία
και η συγκέντρωση πρωτεΐνης. Με τη χρήση γενετικά τροποποιημένων κυτταρικών
σειρών ως μοντέλα παραγωγής DDC και alt-DDC υποδεικνύεται ότι το ΔΚΜ αναστέλλει
την ενζυμική ενεργότητα τόσο της πλήρους μήκους DDC, όσο και της alt-DDC. Η
απομόνωση του αναστολέα από την κυτταρική σειρά U937 πραγματοποιήθηκε
ακολουθώντας ένα πρωτόκολλο το οποίο περιλαμβάνει έξι στάδια καθαρισμού.
Αρχικά, πραγματοποιήθηκε κλασμάτωση ομογενοποιήματος κυττάρων U937 και
απομόνωση του διαλυτού κλάσματος. Δείγματα διαλυτού κλάσματος υπέστησαν
κατεργασία με θειικό αμμώνιο και εν συνεχεία τα προϊόντα της αντίδρασης
διαχωρίστηκαν σε υδρόφοβη στήλη phenyl sepharose. Ο αναστολέας απομονώθηκε μετά
από ανάλυση των πρωτεϊνών που δεν προσδέθηκαν στη στήλη σε μη αποδιατακτικό
πήκτωμα πολυακρυλαμίδης δύο διαστάσεων και συνεπακόλουθο διαχωρισμό και
εκχύλιση των πρωτεϊνών από το πήκτωμα. Το πρωτόκολλο απομόνωσης είχε σαν
αποτέλεσμα τον καθαρισμό του αναστολέα κατά 4.761 φορές. Η μοριακή μάζα του
αναστολέα υπολογίστηκε ίση με 67 kDa, μετά από ανάλυση των δειγμάτων σε SDS
πήκτω
μα πολυακρυλαμίδης. Η ανασταλτική δράση του καθαρού αναστολέα της ενεργότητας
της DDC επηρεάζεται από παραμέτρους, όπως ο χρόνος επώασης, το pH, η
θερμοκρασία και η συγκέντρωση πρωτεΐνης. Πειράματα κινητικής ανάλυσης της
αναστολής της ενεργότητας της DDC από τον καθαρό αναστολέα έδειξαν ότι ο τύπος
της αναστολής είναι μη συναγωνιστικός με τιμή της σταθεράς Ki στα 10,59 μM.
Ανάλυση των καθαρών δειγμάτων μέσω φασματομετρίας μάζας οδήγησαν στην
ταυτοποίηση του αναστολέα ως αλβουμίνη του ορού. Η οριστική επιβεβαίωση της
ταυτοποίησης του αναστολέα πραγματοποιήθηκε με τον έλεγχο επίδρασης υψηλής
καθαρότητας ανθρώπινης αλβουμίνης ορού στην ενζυμική ενεργότητα DDC κυττάρων
ΗΕΚ-293. Η αλβουμίνη του ανθρώπινου ορού, αναστέλλει την ενζυμική ενεργότητα
της DDC όλων των υποκυτταρικών κλασμάτων της κυτταρικής σειράς U937. Με τη
χρήση γενετικά τροποποιημένων κυτταρικών σειρών ως μοντέλα παραγωγής DDC και
alt-DDC υποδεικνύεται ότι η ανθρώπινη αλβουμίνη ορού αναστέλλει την ενζυμική
ενεργότητα τόσο της πλήρους μήκους DDC, όσο και της alt-DDC.
Η απομόνωση και ο βιοχημικός χαρακτηρισμός της αλβουμίνης του ορού ως αναστολέα
της ενζυμικής ενεργότητας της L-Dopa αποκαρβοξυλάσης παρουσιάζει ιδιαίτερο
ενδιαφέρον διότι θα μπορούσε να εμβολιάσει νέες πειραματικές προσεγγίσεις οι
οποίες θα έχουν ως τελικό στόχο την ανάπτυξη νέων φαρμακολογικών και
θεραπευτικών μέσων για την καταπολέμηση νευροεκφυλιστικών και νεοπλασματικών
νόσων.
(EL)
L-3.4-dihydroxyphenyl-alanine decarboxylase (L-Dopa decarboxylase, or DDC, EC
4.1.1.26) is the enzyme which catalyzes the decarboxylation of L-Dopa to
dopamine. Dopamine is considered to be one of the major mediators of the
neural-immune communication since it has been found to be a regulating factor
of the proliferation and differentiation of different leukocyte subtypes.
Leukocytes interact with dopamine when, upon activation, cross the blood-brain
barrier, but also in peripheral tissues as the white blood cells are capable of
endogenous synthesis, secretion and uptake of catecholamines. The regulatory
effect of dopamine occurs via dopamine receptors which are identified in the
plasma membrane of white blood cells. Although several experimental data
suggest the communication between the nervous and immune systems, the
biosynthetic pathway of catecholamines in white blood cells, has not yet been
fully elucidated. Additionally, the experimental data relating to the
regulatory effect of dopamine appear contradictory. The need to further
investigate the role of dopamine on immune system becomes more relevant when
some of the most important neurodegenerative diseases such as Parkinson's
disease and schizophrenia are well-correlated with severe abnormalities of
immune functions. Therefore, fully clarification of the biochemical pathways
dopamine is involved in may help in the understanding of the pathogenesis and
treatment of many neurodegenerative diseases. Based on the above and on recent
studies of our laboratory which revealed for the first time the expression of
the full-length DDC and the alternative transcript lacking exon 3 in human
peripheral leukocytes, the purpose of the present Ph.D. thesis was to further
investigate the expression, the subcellular distribution and the enzymatic
activity regulation of DDC in immune cells of human origin.
The results of this dissertation are summarized as follows:
• Study of the expression, topology and enzymatic activity of DDC in
human peripheral white blood cells.
In order to study the subcellular distribution of DDC in human peripheral white
blood cells, samples of homogenized white blood cells were treated with the
non-ionic detergent Triton X-114. The enzyme recovered both in the detergent
enriched and highly hydrophobic phases, indicating the association of the
molecule with the membrane fraction and the existence of multiple DDC
subpopulations with variable degrees of hydrophobicity. Western blot analysis
resulted in the detection of the alternative DDC isoform, alt-DDC. The enzyme
was found to be active towards the decarboxylation of L-Dopa to DA (mU / mg =
3,67 ± 0,31). Although the obtained activity values were found to be
considerably lower than the activity values observed in human embryonic kidney
K293 cells, which were used as positive controls, the data strongly suggest the
endogenous dopamine production in these types of cells.
• Study of the expression, topology and enzymatic activity of DDC in
U937cell line.
To further investigate the expression, topology, and enzymatic activity of DDC
in immune cells, U937 cell line was used as a model of macrophage function. DDC
was detected for the first time in the cell line U937 by immonoblotting
experiments. The nature of DDC mRNA expressed in U937 cell line was
investigated by reverse transcription-polymerase chain reaction experiments and
further Western bot analysis which lead to the detection of the neural-type DDC
transcript lacking exon 3 and the protein isoform alt-DDC. The full-length
transcript and the non-neural transcript were not detected. The subcellular
distribution of DDC in U937 cell line was investigated using the non-ionic
reagent Triton X-114. Treatment of samples with the detergent resulted in the
recovery of DDC in the hydrophilic, hydrophobic, and the strong hydrophobic
fraction, indicating the association of the enzyme with the membranes of U937
cell line. The membrane-associated DDC subpopulation was found to be released
from the membrane fraction into the soluble fraction in a pH dependent manner
with an optimum release at pH 6.0–6.5. Determination of DDC enzymatic activity
in total homogenate, the soluble and membrane fraction of U937 cells suggests
that DDC is enzymatically active towards the decarboxylation of L-Dopa to
dopamine in all the subcellular fractions. The enzymatic activity levels of DDC
in the membrane fraction were determined by 70% higher than the enzymatic
activity values in total homogenate and the soluble fraction of the cell line.
The solubilized molecule was found to be enzymatically active towards the
decarboxylation of L-Dopa with a peak of activity between pH 6.0–6.5.
Incubation of the membrane fraction in the presence of the soluble fraction
resulted in a decrease of DDC activity suggesting the existence of a regulatory
molecule of DDC activity in the soluble fraction of U937 cell line. Exogenous
administration of the DDC inhibitor, carbidopa, to U937 cell culture for 24
hours was found to be cytotoxic in a dose-dependent manner, suggesting that DDC
may be involved in immune cell survival and cell death mechanisms. Similarly,
incubation of U937 cells in the presence of increasing dopamine concentrations
for 24 hours lead to cell death. These results support the hypothesis that
macrophages are able to uptake extracellular dopamine, which regulates
proliferation and cell death in immune cells.
• Isolation and biochemical characterization of a DDC enzymatic activity
inhibitor from U937 cell line.
The presence of the inhibitor of the enzymatic activity of DDC in U937 cell
line was originally detected after the incubation of homogenized U937 cell
samples in the presence homogenized HEK-293 cell samples which are known to
contain high DDC activity levels. Fractionation experiments of U937 cell
homogenate demonstrated the exclusive localization of the endogenous inhibitor
of the enzymatic activity of DDC in the soluble fraction, suggesting the
subcellular topology of the inhibitor. Further studies through
temperature-induced phase separation in the presence of the non-ionic detergent
Triton X-114 led to the recovery of the inhibitory activity in the aqueous
phase of Triton X-114, confirming the hydrophilic nature of the inhibitory
molecule. Treatment of the soluble fraction of macrophages (SFM) with serine
proteases such as, trypsin, chymotrypsin and proteinase K, resulted in the
total loss of inhibitory activity, suggesting the protein nature of the
inhibitor. Treatment of the SFM with RNAse A verified the protein nature of the
regulatory molecule. The inhibitory activity of the molecule was found to be
regulated by pre-incubation time, pH, temperature and protein concentration.
Using genetically modified cell lines (CHO) to model stable DDC and alt-DDC
expressing cells, it was indicated that the regulatory molecule inhibits the
enzymatic activity of the full length DDC as well as its truncated form,
alt-DDC. Purification was achieved by means of ammonium sulphate precipitation,
phenyl sepharose hydrophobic chromatography and subsequent extraction from a 2D
non denaturing polyacrylamide gel. This purification scheme resulted in a
4.761-fold purification of the DDC activity inhibitory molecule. The molecular
mass of the inhibitor was estimated at 67 kDa, following analysis of the
samples on SDS-PAGE. The inhibitory activity of the purified molecule was found
to be affected by various parameters, such as, protein concentration,
incubation time, pH and temperature. Kinetic analysis experiments on DDC
activity inhibition by the purified inhibitor showed that the mode of
inhibition was competitive with a Ki value of 10.59 μΜ. Mass spectrometry
results suggested that the inhibitor corresponds to serum albumin. Highly
purified human serum albumin was tested for its inhibitory effect on human DCC
activity (HEK-297 cells homogenate). Moreover, human serum albumin was found to
inhibit the enzymatic activity of DDC derived from all the subcellular
fractions of U937 cell line. Incubation of CHO cells transfected either with
DDC or alt-DDC in the presence of the inhibitor indicated that human serum
albumin inhibits the enzymatic activity of both full-length DDC, and alt-DDC.
The purification and biochemical characterization of human serum alboumin as an
inhibitor of the enzymatic activity of L-Dopa decarboxylase demonstrates a
special interest, because it could be included in novel experimental
approaches, which will have as a final target the development of novel
pharmacological and therapeutic means for the combat of neurodegenerative and
neoplasmic diseases.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
