Η απολιποπρωτεΐνη Ε4 (αποΕ4) είναι ο σημαντικότερος δείκτης κινδύνου για τη
σποραδική νόσο Alzheimer (AD), αλλά ο μηχανισμός με τον οποίο η αποΕ4 οδηγεί
στην AD δεν έχει διευκρινιστεί. Για να διερευνηθεί ο ρόλος της αποΕ4 στην AD
απαιτείται καθαρή αποΕ4. Συνεπώς, αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολλο έκφρασης και
καθαρισμού ανασυνδυασμένης αποΕ4. Στο πρωτόκολλο αυτό η αποΕ4 εκφράζεται σε
βακτηριακά κύτταρα συντηγμένη με ετικέτα θειορεδοξίνης και ακολουθεί η
απομάκρυνση της ετικέτας από την υψηλής ειδικότητας 3C πρωτεάση. Η πορεία αυτή
οδηγεί στη γρήγορη και σε υψηλά επίπεδα παραγωγή, δομικά και λειτουργικά ορθής
αποΕ4.
Μια σπάνια φυσικά απαντώμενη μετάλλαξη, η αποΕ4[L28P], έχει συσχετιστεί με
αυξημένο κίνδυνο για τη σποραδική AD, επιπλέον του γνωστού κινδύνου που
επιφέρει η αποΕ4 και μπορεί να αποτελέσει ένα ισχυρό εργαλείο για την κατανόηση
του ρόλου της αποΕ4 στην AD. Για το σκοπό αυτό, μελετήθηκε η επίδραση της
μετάλλαξης L28P στις δομικές και λειτουργικές ιδιότητες της αποΕ4. Η
αποΕ4[L28P], η οποία παράχθηκε μέσω του νέου πρωτοκόλλου, έχει μειωμένο
περιεχόμενο σε α-έλικες, είναι θερμοδυναμικά αποσταθεροποιημένη, εκθέτει
μεγαλύτερη επιφάνεια υδρόφοβων περιοχών της στο διαλύτη και παρουσιάζει
αυξημένη ευαισθησία στην πρωτεόλυση. Επιπρόσθετα, παρατηρούνται λειτουργικές
αλλαγές, αφού η αποΕ4[L28P] προάγει την ενδοκυτταρική συσσώρευση του
εξωκυτταρικού Αβ42 σε κύτταρα νευροβλαστώματος SK-N-SH και σε πρωτογενή
καλλιέργεια νευρώνων μυών και αυξάνει το σχηματισμό κυτταρικών δραστικών μορφών
οξυγόνου (ROS). Επίσης, η αποΕ4[L28P] σχηματίζει λιποπρωτεϊνικά σωματίδια με
δομικές αλλοιώσεις και λιποπρωτεϊνικά σωματίδια που περιέχουν την αποΕ4[L28P]
προωθούν επίσης τον σχηματισμό των ROS και μειώνουν τη βιωσιμότητα των SK-N-SH
κυττάρων. Τα παραπάνω αποτελέσματά υποδεικνύουν ότι η μετάλλαξη L28P επηρεάζει
σημαντικά τη δομή της αποΕ4 τόσο σε μορφή ελεύθερη λιπιδίων όσο και σε
λιποπρωτεϊνικά σωματίδια. Σε αυτές τις αλλαγές μπορεί να οφείλονται οι
λειτουργικές διαταραχές που εμφανίζει η αποΕ4 στους νευρώνες και οι οποίες
μπορεί να σχετίζονται με την παθογένεση της AD.
(EL)
Apolipoprotein E4 (apoE4) isoform has consistently emerged as a susceptibility
factor for sporadic Alzheimer’s disease (AD), although the exact mechanism is
not clear. The elucidation of the pathogenic role of apoE4 in AD requires the
production of large amounts of pure apoE4. For this purpose, we developed a
simple procedure for the expression and purification of recombinant apoE4. Our
approach is based on the expression of a thioredoxin-apoE4 fusion construct in
bacterial cells and subsequent removal of the fused thioredoxin using the
highly specific 3C protease. Our approach results in rapid, high-yield
production of structurally and functionally competent apoE4.
A rare apoE4 variant, apoE4[L28P], burdens carriers with added risk for
sporadic AD and may be a useful tool for gaining insight on the role of apoE4
in disease pathogenesis. Towards this end, we evaluated the effect of the L28P
mutation on the structural and functional properties of apoE4. ApoE4[L28P],
produced with our newly developed approach, was found to have reduced helical
content, to be thermodynamically destabilized and to expose a larger portion
of hydrophobic surface to the solvent. Furthermore, this variant is more prone
to proteolysis. When interacting with lipids, apoE4 [L28P] formed populations
of lipoprotein particles with structural defects. The structural perturbations
brought about by the mutation were accompanied by aberrant functions associated
with the pathogenesis of AD. Specifically, apoE4[L28P] promoted the cellular
uptake of extracellular Aβ42 by human neuroblastoma SK-N-SH cells and primary
mouse neuronal cells and led to increased formation of reactive oxygen species
(ROS) that persisted for at least 24hrs. Finally, lipoprotein particles
containing apoE4[L28P] promoted ROS formation and reduced SK-N-SH cell
viability. Overall, our data suggest that the L28P mutation significantly
affects the structure of apoE4 both in solution and in lipoprotein particles
and that these effects may underlie apoE4 functional disturbances in neurons
that could be associated with AD pathogenesis.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
