Η μεταβολομική έχει αποδειχθεί ότι συμβάλλει σημαντικά στη συστηματική μελέτη
πολύπλοκων μιγμάτων, όπως είναι τα ολικά φυτικά εκχυλίσματα και τα φυτικά
σκευάσματα. Εκτός από την εφαρμογή της στο χαρακτηρισμό του φυτοχημικού προφίλ
και τον ποιοτικό έλεγχο, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για το συσχετισμό των
αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από βιολογικά πειράματα, χωρίς να απαιτείται
απομόνωση των βιοδραστικών συστατικών. Στην παρούσα μελέτη ελήφθησαν 312
εκχυλίσματα από διάφορα φυτικά είδη, τα οποία ανήκουν στις οικογένειες
Compositae, Lamiaceae και Leguminosae, προκειμένου να ληφθεί το μεταβολικό τους
αποτύπωμα και να διερευνηθεί η πιθανή συσχέτιση των μεταβολιτών τους ανά γένος
και οικογένεια.
Αρχικά σχεδιάστηκε το πειραματικό πρωτόκολλο εκχυλίσεων και προετοιμασίας
δειγμάτων για τη λήψη φασμάτων πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Το πρώτο
βήμα περιλάμβανε τις εκχυλίσεις των φυτικών υλικών, οι οποίες πραγματοποιήθηκαν
σε λουτρό υπερήχων, για 15 min σε θερμοκρασία 40 0C και διαλύτη MeOH σε
αναλογία δρόγης/διαλύτη 1/7 (w/v). Στη συνέχεια, τα εκχυλίσματα παρελήφθησαν με
διήθηση και ο διαλύτης εξατμίστηκε υπό κενό, μέχρι ξηρού. Στη δεύτερη φάση 10
mg ξηρού εκχυλίσματος διαλύθηκαν σε 750 μL δευτεριωμένης μεθανόλης
(methanol-d4, 99.8%) που περιείχε 0.03% v/v τετραμεθυλοσιλάνιο
(tetramethylsilane, TMS), ως εσωτερικό πρότυπο. Τα πρώτα αποτελέσματα από τη
λήψη φασμάτων NMR έδειξαν ότι μπορεί να ληφθεί ένα χαρακτηριστικό μεταβολικό
αποτύπωμα για το κάθε είδος.
Με σκοπό τη δημιουργία ενός μοντέλου ομαδοποίησης των δειγμάτων με βάση το
μεταβολικό τους αποτύπωμα, χρησιμοποιήθηκαν μη επιβλεπόμενες (PCA) και
επιβλεπόμενες (PLS-DA, OPLS-DA) πολυπαραμετρικές μέθοδοι. Τα αποτελέσματα της
πολυπαραμετρικής ανάλυσης με PLS-DA και OPLS-DA έδειξαν ότι υπάρχει σαφής
διάκριση μεταξύ των δειγμάτων που ανήκουν σε διαφορετικές οικογένειες και ότι
είναι εφικτή η ταξινόμησή τους στις ομάδες Compositae, Lamiaceae και
Leguminosae. Επιπλέον, φάνηκε ότι και εντός της ίδιας οικογένειας υπήρχε
διάκριση μεταξύ των διαφορετικών γενών, ακόμη και ειδών. Η διάκριση μπορούσε να
επιτευχθεί ακόμη και στην περίπτωση φυτών που περιείχαν μεταβολίτες της ίδιας
χημικής κατηγορίας. Επίσης, εντοπίστηκαν οι στατιστικά σημαντικές μεταβλητές
και μάλιστα παρατηρήθηκε ότι η διαφοροποίηση οφείλεται κυρίως στις περιοχές
χημικών μετατοπίσεων 1.00 - 4.00 ppm, στις οποίες απαντώνται κορυφές που
ανήκουν κυρίως σε σάκχαρα και τερπενοειδή, ενώ μόνο στην περίπτωση των ομάδων
Compositae και Lamiaceae η διαφοροποίηση οφειλόταν σε σήματα περίπου στα 6.00
ppm, τα οποία είναι πιθανό να συσχετίζονται με αρωματικούς μεταβολίτες.
Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, διάφορα είδη από τα γένη που μελετήθηκαν εμφανίζουν
σημαντικές βιολογικές δράσεις. Σε αυτή την εργασία, αξιολογήθηκαν οι
αντιοξειδωτικές και οι λευκαντικές ιδιότητες των παραγόμενων εκχυλισμάτων,
προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή συσχέτιση της βιολογικής δράσης με σήματα
στα φάσματα ΝMR και κατ’ επέκταση με συγκεκριμένους μεταβολίτες. Όπως
αποδείχτηκε, κατάλληλα μοντέλα θα μπορούσαν να δημιουργηθούν, από τα οποία η
βιολογική δράση θα μπορούσε να προβλεφθεί από τα φάσματα NMR.
(EL)
The study of metabolomics has been proven to be a powerful key to the
systematic study of complex mixtures, such as natural extracts and herbal
preparations. Apart from its usage in phytochemical profiling and quality
control studies, metabolomics could be adapted in correlation with results
obtained through biological testing systems, without isolating the bioactive
compounds. Concerning this particular study 312 extracts that belong to the
families Compositae, Lamiaceae and Leguminosae were obtained in order to
identify their metabolic fingerprint and to investigate the correlation of
metabolites by genus and family.
An experimental protocol for extraction and NMR sample preparation was
initially designed. The first step regarding the protocol, includes the plant
extractions with ultrasounds. The pulverized plants were mixed with MeOH (1/7
w/v) and were processed with ultrasounds at 40 0C, for 15 minutes. Then the
extracts were collected and the solvent was evaporated in vacuum to dryness. At
the second step 10 mg of the dry extracts were dissolved in 750 μL methanol-d4,
99.8%, which contained 0.03% tetramethylsilane (TMS) as standard internal. The
initial results showed that a characteristic metabolic fingerprint can be
obtained for each species.
Unsupervised multivariate method of Principal Component Analysis (PCA),
supervised multivariate methods Partial Least Square-Discriminant Analysis
(PLS-DA) and Orthogonal-PLS (OPLS-DA) were used in order to generate a model.
The multivariate statistical analysis of PLS-DA and OPLS-DA showed a clear
distinction and noticeable differentiation between different families and that
their classification in groups of Compositae, Lamiaceae and Leguminosae is
possible. Moreover, it was observed that within the family showed distinction
between different genus and species. Even in the case of plants containing
metabolites of the same chemical class, a clear distinction could be achieved.
Furthermore the most statistically significant variables were detected. The
differentiation was observed in the spectrum area 1.00- 4.00 ppm, in which
mainly sugars and terpenoids peaks are located. Specifically, Compositae and
Lamiaceae differentiation was due to signals of 6.00 ppm that belong in the
aromatic area.
According to academic references, the genus that were studied, displayed a
significant biological activity. In this study, the antioxidant and whitening
activity was studied in order to investigate the correlation between biological
activity and signals in NMR spectra and thus to specific metabolites. It is
concluded that, suitable models could be created, from which the biological
activity could be predicted from NMR spectra.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
