Ο ρόλος του ασβεστίου στα επαγόμενα από διάφορες μορφές στρες σηματοδοτικά μονοπάτια σε καρδιακούς μυοβλάστες H9c2

Ο ρόλος του ασβεστίου στα επαγόμενα από διάφορες μορφές στρες σηματοδοτικά μονοπάτια σε καρδιακούς μυοβλάστες H9c2

Τρυφωνίδη Ιουλία (EL)

born_digital_postgraduate_thesis

Διπλωματική Εργασία (EL)

Postgraduate Thesis (EN)

2013

Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας, αποτελεί η μελέτη του ρόλου του ασβεστίου στα επαγόμενα από διάφορες μορφές στρες σηματοδοτικά μονοπάτια, σε καρδιακούς μυοβλάστες της κυτταρικής σειράς H9c2. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν οι ουσίες Φαινυλεφρίνη και Ισοπροτερενόλη, συνθετικά ανάλογα των κατεχολαμινών που προκαλούν α- και β-αδρενεργική διέγερση, αντίστοιχα. Η πειραματική διαδικασία περιελάμβανε ανοσοδοκιμασίες Western Blot έναντι των πρωτεϊνών p-ERKs σε κυτταρικά εκχυλίσματα H9c2 καθώς και δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας MTT σε κυτταρική καλλιέργεια καρδιακών μυοβλαστών H9c2. Όπως αποδείχτηκε, η Φαινυλεφρίνη επάγει την ενεργοποίηση των ERKs κατά δοσοεξαρτώμενο και χρονοεξαρτώμενο πρότυπο. Η ενεργοποίηση αυτή είναι η μέγιστη δυνατή όπως φαίνεται από τη σύγκριση με την ενεργοποίηση που προκαλείται από τον Φορβολεστέρα (PMA), ενώ αναστέλλεται πλήρως με τη χρήση του ειδικού αναστολέα των ERKs PD98059. Με τη χρήση των αναστολέων των διαύλων ασβεστίου τύπου L, Νιφεδιπίνη και Βεραπαμίλη αποδείχτηκε ότι στην ενεργοποίηση των ERKs συμμετέχουν και τα ιόντα ασβεστίου που προέρχονται από τον εξωκυττάριο χώρο, ενώ ο ενδοκυτταρικός χηλικός παράγοντας BAPTA-AM δεν φάνηκε να επηρεάζει την επαγόμενη από τη Φαινυλεφρίνη, φωσφορυλίωση των ERKs. Όπως στην α- έτσι και στη β-αδρενεργική διέγερση, η Ισοπροτερενόλη προκαλεί τη φωσφορυλίωση των ERKs κατά δοσοεξαρτώμενο και χρονοεξαρτώμενο πρότυπο. Η φωσφορυλίωση αυτή φαίνεται να αναστέλλεται μερικώς από τον αναστολέα διαύλων ασβεστίου τύπου L, Βεραπαμίλη, ενώ επηρεάζεται ελάχιστα από τον αναστολέα διαύλων ασβεστίου τύπου L, Νιφεδιπίνη και καθόλου από τον ενδοκυτταρικό χηλικό παράγοντα BAPTA-AM. Στη συνέχεια μελετώντας τις μακροχρόνιες επιδράσεις της ισοπροτερενόλης διαπιστώσαμε ότι η 24ωρη επίδραση της προκαλεί ένα χρονοεξαρτώμενο πρότυπο μεταβολής των ERKs το οποίο δίνει ένα δεύτερο μέγιστο στις 16 ώρες εφαρμογής της, με παράλληλη αύξηση της βιωσιμότητα των κυττάρων. Αντίθετα, η επίδραση της ισοπροτερενόλης για 48 ώρες, προκάλεσε κυτταρικό θάνατο, ο οποίος δεν επηρεάστηκε από τους αναστολείς ασβεστίου, αλλά ενισχύθηκε από τον ειδικό αναστολέα των ERKs PD98059. Τα αποτελέσματα αυτά σχετικά με το ρόλο του ασβεστίου στην α- και β-αδρενεργική διέγερση είναι ιδιαίτερα ενδιαφέροντα και χρήζουν περαιτέρω διερεύνηση. (EL)

The aim of this study is to elucidate the role of calcium in the signaling pathways induced by various forms of stress, using the cardiac myoblasts of the cell line H9c2. For this reason, we used the compounds phenylephrine and isoproterenol, synthetic analogues of catecholamines that cause a-and b-adrenergic stimulation, respectively. The experimental procedure included Western Blot immunoassays against p-ERKs proteins in cell extracts and MTT cytotoxicity assays using culture cardiac myoblasts of the cell line H9c2. As the results revealed, Phenylephrine induces activation of ERKs in a dose- dependent and time-dependent manner. This activation is the maximum possible compared to that induced by phorbol ester (PMA) and is completely inhibited by the specific ERKs inhibitor PD98059. Using the inhibitors of calcium pump type L, Nifedipine and Verapamil we proved that calcium ions from the extracellular space are also involved in the activation of ERKs, while the intracellular chelator BAPTA-AM did not affect the induced by phenylephrine phosphorylation of ERKs. As in a- so in b-adrenergic stimulation, isoproterenol induces the phosphorylation of ERKs in a dose-dependent and time-dependent manner. The phosphorylation appears to be inhibited by the inhibitor of calcium channel type L Verapamil, minimally affected by the inhibitor of calcium channel type L Nifedipine, and is not affected by the intracellular chelator BAPTA-AM. Then, studying the long-term effects of isoproterenol, we found that the 24 hour effect causes a time-dependent pattern of ERKs which produces a second maximum at 16 hours post-application, increasing in parallel the cell viability. In contrast, the 48 hours effect of isoproterenol caused cell death, which was not affected by calcium blockers, but enhanced by the specific ERKs inhibitor PD98059. All these results for the role of calcium in alpha-and beta-adrenergic stimulation are really interesting and deserve further investigation. (EN)

Greek

Σχολή Θετικών Επιστημών » Τμήμα Βιολογίας » Τομέας Φυσιολογίας Ζώων και Ανθρώπου

Βιβλιοθήκη και Κέντρο Πληροφόρησης » Βιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών

https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Πέργαμος

Postgraduate Thesis