Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του Ευρωπαϊκού προγράμματος (Horizon 2020), TASCMAR. Βασικός στόχος του συγκεκριμένου ερευνητικού προγράμματος είναι η ανακάλυψη και εφαρμογή νέων φυσικών προϊόντων που προέρχονται από το θαλάσσιο οικοσύστημα και εμφανίζουν αξιόλογη αντιγηραντική δράση. Για το λόγο αυτό, έγινε συλλογή περισσότερων από 280 θαλάσσιων ασπόνδυλων και 400 μικροοργανισμών από τη μεσοφωτική ζώνη (βάθος μεταξύ 30 και 100 μέτρων) του Ινδικού Ωκεανού (μεταξύ Ile de la Réunion και Μαδαγασκάρης), των ακτών της Ταϊλάνδης, της Ερυθράς Θάλασσας και της Ανατολικής Μεσογείου. Όλα τα αρχικά εκχυλίσματα των δειγμάτων υποβλήθηκαν τόσο σε in-vitro όσο και σε in-vivo βιολογικές δοκιμές. Οι επιλεγμένοι στόχοι αφορούν μόρια που έχουν την ικανότητα να παρεμβαίνουν στις μοριακές ή κυτταρικές διεργασίες γήρανσης ή/και αγγειογένεσης. Για την αποτελεσματική βιοκατευθυνόμενη απομόνωση και στη συνέχεια ταυτοποίηση των βιοδραστικών δευτερογενών μεταβολιτών εφαρμόστηκαν προηγμένες αναλυτικές τεχνικές.
Πιο συγκεκριμένα, 61 θαλάσσια ασπόνδυλα τα οποία συλλέχθηκαν από τη μεσοφωτική ζώνη τόσο του ωκεανού της Ταϊλάνδης όσο και της Ερυθράς Θάλασσας, αφού καταψύχθηκαν στους -80°C, λυοφιλοποιήθηκαν, εκχυλίστηκαν με τη μέθοδο της επιταχυνόμενης εκχύλισης και αξιολογήθηκαν για την αντιγηραντική τους δράση. Από τα αρχικά εκχυλίσματα αυτών των 61 ασπόνδυλων επιλέχθηκαν ως πρωταρχικοί στόχοι για περαιτέρω επεξεργασία τα 14 από αυτά που παρουσίασαν αξιόλογη αναστολή των ενζύμων της ελαστάσης και της τυροσινάσης και κινασών καθώς και αναστολή ή ενεργοποίηση του πρωτεασώματος. Στη συγκεκριμένη εργασία μεταπτυχιακού διπλώματος ειδίκευσης, μελετήθηκαν λεπτομερώς 3 εκχυλίσματα σπόγγων του γένους Iotrochota και Biemna και του είδους Calyx nicaeensis.
Η κλασμάτωση και ανάλυση πραγματοποιήθηκε με διάφορες χρωματογραφικές τεχνικές, όπως τη χρωματογραφία προσρόφησης σε στήλη μέσης πίεσης και βαρύτητας, τη χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού, την παρασκευαστική χρωματογραφία λεπτής στιβάδας αλλά και την χρωματογραφία υψηλής απόδοσης.
Μετά από βιοδοκιμές ως προς την αντιγηραντική και λευκαντική δράση όλων των κλασμάτων που προέκυψαν, επεξεργάστηκαν περαιτέρω προς απομόνωση μεταβολιτών αυτά που εμφάνισαν έντονη αναστολή του ενζύμου της τυροσινάσης.
Συνολικά απομονώθηκαν εννέα δευτερογενείς μεταβολίτες οι οποίοι ταυτοποιήθηκαν μέσω φασματοσκοπίας NMR (1D & 2D), UHPLC-HRMS και GC-MS. Πρόκειται για ήδη γνωστές ενώσεις οι οποίες, όμως, απομονώθηκαν για πρώτη φορά από τους συγκεκριμένους σπόγγους. Ανήκουν σε διάφορες χημικές κατηγορίες όπως σεστερτερπένια, στερόλες και φθαλικοί εστέρες.
Όλοι οι απομονωμένοι μεταβολίτες βρίσκονται υπο αξιολόγηση σε in-vitro και in-vivo πειράματα προκειμένου να διερευνηθεί πλήρως η βιολογική δράση των μοριών αυτών και η ασφάλεια τους προκειμένου να μπορέσουν να χρησιμοποιηθούν στην βιομηχανία καλλυντικών.
(EL)
The present study was carried out in the frames of the European programme (Horizon 2020), TASCMAR. The main objective of this research project is the discovery and application of new natural products derived from the marine ecosystem and have a remarkable anti-aging effect. For this reason, more than 280 marine invertebrates and 400 microorganisms were collected from the under-investigated mesophotic zone (depth of between 30 and 100 meters) of the Indian Ocean (between Ile de la Réunion and Madagascar), the Thailand coasts, the Red Sea and the Eastern Mediterranean. All the initial samples extracts were evaluated on both in-vitro and in-vivo bioassays. Chosen targets were molecules capable of interfering with the molecular or cellular processes of ageing and/or angiogenesis. For the efficient bioguided isolation and identification of bioactive secondary metabolites were applied advanced analytical techniques.
More specifically, the 61 marine invertebrates that were collected from both oceans of Thailand and the Red Sea, after being frozen at -80°C, were lyophilized, extracted by Accelerated Solvent Extraction and evaluated for their anti-aging activity. Of all the extracts of these 61 invertebrates, 14 showed significant inhibition of elastase and tyrosinase enzyme, kinase as well as inhibition or activation of the proteasome and were selected as primary targets for further processing. In the context of this master thesis, were selected for further study 3 sponges extracts of the genus Iotrochota and Biemna and of the species Calyx nicaeensis.
Further fractionation and analysis were performed by various chromatographic techniques, such as medium pressure and gravity column chromatography, molecular exclusion chromatography, preparative thin-layer chromatography, and high-performance chromatography.
Based on fractions evaluation on the anti-aging and skin whitening activity by bioassays, were selected those that showed a strong inhibition of tyrosinase for further isolation of metabolites.
In total nine secondary metabolites were isolated and identified by NMR spectroscopy (1D & 2D), UHPLC-HRMS and GC-MS. These are already known compounds which, however, were isolated for the first time from these specific sponges. They belong to various chemical categories such as sesterterpenes, sterols and phthalates.
All the isolated metabolites are being evaluated by in-vitro and in-vivo experiments in order to fully investigate the biological activity and the safety of these molecules so as to be able to be used in the cosmetics industry.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
