Ανάπτυξη και εφαρμογή μεθοδολογιών ανάλυσης για την απομόνωση, τον ποιοτικό και ποσοτικό χαρακτηρισμό δευτερογενών μεταβολιτών από γενετικά τροποποιημένες βακτηριακές καλλιέργειες Escherichia coli.

Ανάπτυξη και εφαρμογή μεθοδολογιών ανάλυσης για την απομόνωση, τον ποιοτικό και ποσοτικό χαρακτηρισμό δευτερογενών μεταβολιτών από γενετικά τροποποιημένες βακτηριακές καλλιέργειες Escherichia coli.

Χαλκιαδάκη Μαρία (EL)

Chalkiadaki Maria (EN)

born_digital_postgraduate_thesis

Διπλωματική Εργασία (EL)

Postgraduate Thesis (EN)

2020

Η υδροξυτυροσόλη αποτελεί ένα από τα πλέον βιοδραστικά φυσικά προϊόντα, το οποίο είναι άμεσα συνδεδεμένο με τα προϊόντα της ελιάς και χαρακτηρίζεται από πληθώρα ευεργετικών ιδιοτήτων για τον άνθρωπο. Η υδροξυτυροσόλη είναι εμπορικά διαθέσιμη και τα τελευταία χρόνια η πρόοδος της Γενετικής Μηχανικής άνοιξε ένα νέο πεδίο έρευνας για την παραγωγή της μέσω βιοτεχνολογικά τροποποιημένων οργανισμών. Η ποιοτική και ποσοτική ανάλυση βακτηριακών καλλιεργειών φέρει πολλές και σημαντικές προκλήσεις στο πεδίο των Φυσικών Προϊόντων τόσο λόγω της αστάθειας της HT καθαυτής όσο και λόγω της πολυπλοκότητας του δείγματος στο οποίο αυτή ευρίσκεται. Η παραγωγή ΗΤ σε μεγάλες ποσότητες από γενετικά τροποποιημένους μικροοργανισμούς δημιούργησε την ανάγκη για περαιτέρω έρευνα, με σκοπό την ανάκτηση του μορίου σε υψηλή καθαρότητα από τέτοιου είδους πρώτες ύλες όσο και για την ανάπτυξη μεθοδολογιών ποσοτικού προσδιορισμό της σε βακτηριακές καλλιέργειες η οποίες αποτελούν μίγματα υψηλής πολυπλοκότητας. Βασιζόμενοι στις παραπάνω τάσεις και στις βιβλιογραφικές ελλείψεις του παραπάνω πεδίου στην παρούσα εργασία: α) αναπτύχθηκε πρωτόκολλο εκλεκτικής απομόνωσης υδροξυτυροσόλης από βακτηριακές καλλιέργειες, β) αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού ΗΤ και γ) αποσαφηνίστηκε το ακολουθούμενο βιοσυνθετικό μονοπάτι των βακτηριακών καλλιεργειών που χρησιμοποιήθηκαν για την πραγμάτωση της εργασίας. Για την ανάπτυξη του πρωτοκόλλου εκλεκτικής απομόνωσης ΗΤ χρησιμοποιήθηκε βιοτεχνολογικά τροποποιημένη βακτηριακή καλλιέργεια η οποία παράγει υδροξυτυροσόλη σε υψηλά ποσοστά. Η μέθοδος βασίστηκε στη χρήση ρητινών, οι οποίες έχουν το πλεονέκτημα βιομηχανικής εφαρμογής και επιτεύχθηκε ανάκτηση ΗΤ σε υψηλή καθαρότητα. Ακολούθως, αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού ΗΤ με HPLC-UV σε μήτρα βακτηριακών καλλιεργειών. Η μέθοδος εφαρμόστηκε σε γενετικά ανασυνδυασμένες βακτηριακές καλλιέργειες και αναδείχθηκε ο πιο αποτελεσματικός συνδυασμός γονιδίων για τη μέγιστη παραγωγή υδροξυτυροσόλης καθώς και ο απαιτούμενος χρόνος ανάπτυξης για την επίτευξη της μέγιστης παραγωγής. Τέλος, δείγματα ανασυνδυασμένων βακτηρίων αποτελούμενα από διάφορους συνδυασμούς γονιδιακών αλληλουχιών αναλύθηκαν με φασματομετρία μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας (UPLC-HRMS) και ακολούθως επεξεργάστηκαν στατιστικά, με σκοπό τη διερεύνηση των ακολουθούμενων βιοσυνθετικών μονοπατιών από τα βακτηριακά στελέχη, μέσω της ανίχνευσης και ανάδειξης σημαντικών μεταβολιτών. (EL)

Hydroxytyrosol is a bioactive natural compound directly associated with olive products and is characterized by plentiful health beneficial effects. Hydroxytyrosol is a commercial available product and the last years the evolution of Genetic Engineering has introduced the field of hydroxytyrosol production from genetically modified microorganisms. The qualitative and quantitative analysis of bacterial cultures have arisen new challenges in the field of natural products, due to the unstable nature of hydroxytyrosol itself as well as samples complexity. The production of hydroxytyrosol in high quantities from genetically modified microorganisms has arisen the need for further research, aiming the recovery of the molecule in high purity in bacterial cultures and the development of methodologies for HT quantitation in such raw materials, which are characterized by high chemical complexity. Based on the above trends and the gaps in bibliography in the current study: a) a protocol was developed for the selective isolation of hydroxytyrosol from bacterial cultures, b) a methodology was developed and validated for the quantitative determination of HT and c) the biosynthetic pathway of the used bacterial cultures was discovered. For the selective isolation of hydroxytyrosol, a genetically modified bacterial culture was used, which is characterized by high production of HT. For the isolation process, resins were used due to their application in the field of industry and hydroxytyrosol was isolated in high purity. Then, a methodology was developed and validated for the quantitative determination of HT via HPLC-UV in bacterial culture matrix. The methodology was applied on genetically modified bacterial cultures and the most effective gene combination was revealed in parallel with the required incubation period for the achievement of the highest hydroxytyrosol production. Finally, genetically modified samples with different encoding of genes were analyzed via high resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) and then statistically processed with aim the investigation of the followed biosynthetic pathways and the detection of significant metabolites. (EN)

Θετικές Επιστήμες

Θετικές Επιστήμες (EL)

Science (EN)

Ελληνική γλώσσα

Σχολή Θετικών Επιστημών » Τμήμα Φαρμακευτικής » ΠΜΣ Φαρμακευτικής » Κατεύθυνση Απομόνωση, Ανάπτυξη, Παραγωγή και Έλεγχος Βιοδραστικών Φυσικών Προϊόντων

Βιβλιοθήκη και Κέντρο Πληροφόρησης » Βιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών

https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Πέργαμος

Διπλωματική Εργασία