Η ογκοπρωτεΐνη BRAF είναι μέλος της οικογένειας των RAF πρωτεϊνών που αποτελούν συνιστώσες του σηματοδοτικού μονοπατιού RAS-RAF-MEK-ERK (ΜΑPK) το οποίο ελέγχει την κυτταρική ανάπτυξη, διαφοροποίηση καθώς και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.
Μεταλλάξεις στην ογκοπρωτεΐνη BRAF έχουν παρατηρηθεί σε αρκετούς τύπους καρκίνου συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος, του καρκίνου του παχέος εντέρου, του καρκίνου του θυρεοειδούς, της τριχωτής λευχαιμίας και σε μικρότερο ποσοστό σε καρκίνους του πνεύμονα και των ωοθηκών. Η συχνότερη μετάλλαξη που παρατηρείται είναι η V600E, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την ανεξέλεγκτη λειτουργία της ογκοπρωτεΐνης BRAF και ως συνέπεια τη συνεχή ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού.
Μέχρι σήμερα έχουν πραγματοποιηθεί προσπάθειες για την εύρεση αναστολέων της BRAF ογκοπρωτεΐνης. Χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι το Dabrafenib και το Vemurafenib αποτελούν δύο εγκεκριμένους από τον FDA εκλεκτικούς αναστολείς της BRAFV600E, οι οποίοι έχουν βελτιώσει σημαντικά την επιβίωση των ασθενών προχωρημένου σταδίου μελανώματος.
Η μονοθεραπεία με τους BRAFV600E αναστολείς επάγει δευτερογενή νεοπλάσματα, εξαιτίας της παράδοξης ενεργοποίησης του MAPK μονοπατιού που επάγεται από το χορηγούμενο αναστολέα. Παράλληλα, η επίκτητη αντοχή που παρουσιάζεται στο μελάνωμα καθώς και η αντοχή που παρουσιάζεται σε άλλους καρκίνους περιορίζουν περαιτέρω σημαντικά τη δράση τους καθιστώντας την ανακάλυψη νέων αναστολέων επιτακτική.
Οι ερευνητικές προσπάθειες για να ξεπεραστεί η παράδοξη ενεργοποίηση οδήγησαν στους ονομαζόμενους paradox breakers (PLX7904 και PLX8394 με το δεύτερο να είναι επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές). Οι νέοι αναστολείς πλεονεκτούν έναντι των εγκεκριμένων φαρμάκων δεδομένου ότι καταστέλλουν τα μεταλλαγμένα κύτταρα BRAF χωρίς παράδοξη ενεργοποίηση του μονοπατιού MAPK σε κύτταρα WT-BRAF και επιπλέον, φαίνεται να είναι αποτελεσματικοί έναντι αρκετών μηχανισμών αντοχής.
Στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας αναζητήθηκαν με εφαρμογή in silico προσεγγίσεων νέοι εξειδικευμένοι αναστολείς της BRAFV600E. Προηγούμενες μελέτες της Ομάδας Μοριακής Ανάλυσης, του Ινστιτούτου Χημικής Βιολογίας του ΕΙΕ, οδήγησαν στην ανακάλυψη μίας νέας πρόδρομης ένωσης (hit713) με δυνατότητα αναστολής της BRAFV600E μέσω εφαρμογής εικονικής σάρωσης στη βιβλιοθήκη ενώσεων Mcule. Στην παρούσα εργασία επιχειρήθηκε η περαιτέρω αναζήτηση όμοιων δομών προς το hit713 με σάρωση της βιβλιοθήκης Mcule και χρήση αλγόριθμου χημικής ομοιότητας. Οι δομές που προέκυψαν αξιολογήθηκαν ως προς την in silico πρόσδεσή τους στο ενεργό κέντρο της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας το κρυσταλλικό σύμπλοκο του paradox breaker PLX7904.
Στα πλαίσια των προσπαθειών βελτιστοποίησης, σε συνεργασία με το Εργαστήριο Οργανικής & Οργανομεταλλικής Χημείας (EY Δρ Ι. Κώστας) του ΙΧΒ/ΕΙΕ και στα πλαίσια διδακτορικής διατριβής που βρίσκεται σε εξέλιξη σχεδιάζονται ορθολογικά και συντίθενται νέες ενώσεις ανάλογες του hit713.
Στο δεύτερο μέρος της παρούσας εργασίας διενεργήθηκε in vitro αξιολόγηση του hit713 και των πλέον δραστικών νέων συντεθειμένων αναλόγων (σύμφωνα με δοκιμές που έχουν διενεργηθεί σε ενζυμικό assay) σε κυτταρικές σειρές μελανώματος ομόζυγες ή ετερόζυγες ως προς την BRAFV600E μετάλλαξη αλλά και σε wtBRAF σειρές με μετάλλαξη στο RAS, με εφαρμογή της ΧΤΤ Δοκιμασίας Βιωσιμότητας κυττάρων. Τα in vitro πειράματα υλοποιήθηκαν υπό την επίβλεψη του Δρ. Π. Γεωργιάδη, Ερευνητική Ομάδα «Περιβάλλον και Υγεία», IXB/EIE.
(EL)
BRAF protein is a member of RAF family proteins and is an important component of the RAS-RAF-MEK-ERK (MAPK) signaling pathway which controls cell growth, differentiation, and proliferation.
BRAF mutation plays a major role in the development of many human tumors such as melanoma (>50%), colon cancer (5-10%), hairy cell leukemia (100%). It is also often present in thyroid carcinomas (25%-45%) and less commonly in lung and ovarian cancers. The most common mutation is the BRAF V600E which is a hyperactivating point mutation leading to uncontrolled cell growth and survival.
Vemurafenib and Dabrafenib are two FDA approved drugs targeting specifically the BRAF V600E oncogenic mutation, which have significantly improved the survival of patients that suffer from metastatic melanoma.
Despite the initial response the disease often progresses in less than a year, due to acquired resistance. Furthermore, cancers like colon cancer are primary resistant to BRAF inhibitors. Notably, secondary skin cancers are often developed after months of monotherapy treatment because the inhibitors paradoxically activate the MAPK signaling pathway in WT-BRAF cells. Thus, there is an urgent need towards the discovery of new selective and potent mutated BRAF inhibitors.
Research efforts to overcome paradoxical activation have led to so-called paradox breakers (PLX7904 and PLX8394 with the latter currently in clinical trials). The new inhibitors have an advantage over approved drugs as they suppress mutant BRAF cells without paradoxically activating the MAPK pathway in WT-BRAF cells and, in addition, they seem to be effective against several resistance mechanisms.
The first part of the current thesis includes in silico approaches towards the identification of novel specific BRAFV600E inhibitors. Previous studies of the Molecular Analysis Team, of the Institute of Chemical Biology of NHRF, led to the discovery of a lead compound (hit713) with low μΜ inhibitory activity against BRAFV600E. In the current thesis, Mcule database was exhaustively screened for structures similar to hit713 by applying molecular similarity algorithms. The retrieved structures were evaluated for their in silico binding to the active site of the mutant protein using the paradox breaker PLX7904 crystal complex.
In the context of our collaboration with the Organic & Organometallic Chemistry Team of ICB/NHRF (PI: Dr. I. Costas) and within the frame of an ongoing doctoral thesis, a lead optimization process is currently in progress comprising the design and synthesis of new modified analogs.
In the second part of the current thesis, hit 713 and the most active new synthesized analogs (according to their inhibitory effect as measured at the kinase assay) were evaluated in vitro against melanoma cell lines homozygous or heterozygous for the BRAFV600E mutation or wtBRAF cell lines bearing RAS mutation. The XTT Cell Viability Test was applied. The in vitro experiments were performed under the supervision of Dr. P. Georgiadis, Research Group "Environment and Health", ICB / NHRF.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
