Η απομόνωση και η ταυτοποίηση φυσικών προϊόντων με αξιόλογες βιολογικές ιδιότητες είναι μια από τις κύριες κατευθύνσεις του Εργαστηρίου Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων. Στα πλαίσια αυτής της μεταπτυχιακής εργασίας μελετήθηκε το μεταβολικό φορτίο των ριζών του Iris albicans της οικογένειας Iridaceae. Προγενέστερες μελέτες, οι οποίες έχουν πραγματοποιηθεί σε άλλα είδη του ίδιου γένους, έχουν καταλήξει στην απομόνωση και ταυτοποίηση πληθώρας δευτερογενών μεταβολιτών με τα φλαβονοειδή και τα τριτερπένια να αποτελούν τις πιο ενδιαφέρουσες, τόσο από την φυτοχημική πλευρά όσο και από την άποψη των βιολογικών ιδιοτήτων. Οι αναφορές στη διεθνή βιβλιογραφία είναι ελάχιστες ως προς το φυτοχημικό περιεχόμενο των ριζών και ακόμη λιγότερο ως προς την πιθανή αντικαρκινική δράση δευτερογενών μεταβολιτών από τις ρίζες του Iris albicans. Σκοπός της παρούσης μελέτης ήταν η φυτοχημική μελέτη των ριζών του προαναφερόμενου είδους, για την απομόνωση και ταυτοποίηση δευτερογενών μεταβολιτών και η περαιτέρω μελέτη τους για πιθανή αντί-καρκινική δράση απέναντι σε έξι καρκινικές κυτταρικές σειρές του καρκίνου του μαστού.
Ποιο συγκεκριμένα, έγινε συλλογή ολόκληρου του φυτού και μετά το διαχωρισμό σε υπόγεια (ρίζες) και υπέργεια (στελέχη και φύλλα) τμήματα ακολούθησε ξήρανση, κονιοποίηση και εξαντλητική εκχύλιση με διαλύτες διαφορετικών πολικοτήτων. Μετά την αξιολόγηση των παραγόμενων εκχυλισμάτων με τις τεχνικές TLC και 1H NMR, επιλέχθηκε το εκχύλισμα του οξικού μεθυλεστέρα των ριζών (EtOAc-Ρίζες) για περαιτέρω μελέτη. Το προαναφερόμενο εκχύλισμα κλασματώθηκε με υγρή χρωματογραφία στήλης υπό κενό (VLC) και προέκυψαν μετά από τις κατάλληλες συννενώσεις 13 κλάσματα, τα οποία διαχωρίστηκαν με βάση το χημικό περιεχόμενό τους σε (α) μεσαίας έως υψηλής πολικότητας κλάσματα που είναι πλούσια σε φαινολικούς δευτερογενείς μεταβολίτες (κυρίως ισοφλαβόνες και απλές φαινόλες) και (β) σε χαμηλής έως μεσαίας πολικότητας κλάσματα που είναι πλούσια σε τερπενικές ενώσεις (κυρίως στερόλες και ιριδάλες). Ως κύρια μέθοδο διαχωρισμού και απομόνωσης επιλέχθηκε η χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC). Από τα κλάσματα της VLC με πλουσιότερο φαινολικό φορτίο επιλέχθηκαν τα κλάσματα 12 και 13, από τα οποία με τη χρήση αντίστροφης φάσης (RP) HPLC απομονώθηκαν 8 δευτερογενείς μεταβολίτες: 6 ισοφλαβόνες, 1 απλό βενζολικό παράγωγο και 1 υποκατεστημένη διφαινυλοκετόνη. Αντίστοιχα, στα κλάσματα που ήταν πιο πλούσια σε τερπενικές ενώσεις, επιλέχθηκε το κλάσμα 4 για περαιτέρω μελέτη. Από το προαναφερόμενο κλάσμα, με τη χρήση κανονικής φάσης (NP) HPLC, απομονώθηκαν ως μίγμα 2 δευτερογενείς μεταβολίτες που ανήκουν στην χημική κατηγορία των στερολών. Εκτός από τους 2 προαναφερθέντες μεταβολίτες, προέκυψαν και μίγματα τριτερπενίων, τα οποία περιείχαν 2 ή περισσότερες ιριδάλες και χρήζουν περαιτέρω φυτοχημικής μελέτης. Όλοι οι δευτερογενείς μεταβολίτες ταυτοποιήθηκαν με τη λήψη και μελέτη φασμάτων πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού και φασματογραφίας μαζών HRESI-(-)MS. Τέλος, η πλειονότητα των απομονωμένων δευτερογενών μεταβολιτών και επιλεγμένα μείγματα Ιριδαλών αξιολογήθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις για την ανασταλτική τους δράση έναντι του κυτταρικού πολλαπλασιασμού 6 καρκινικών κυτταρικών σειρών γυναικείου καρκίνου του μαστού.
(EL)
The isolation and identification of natural products with notable biological properties is one of the main objectives of the Laboratory of Pharmacognosy and Natural Products. In this master thesis, we explored the secondary metabolite content of the roots of Iris albicans from the Iridaceae family. Previous phytochemical studies have been performed on various species of the same genus and have resulted in the isolation and the identification of a plethora of secondary metabolites from which flavonoids and triterpenoids stand out, due to their intriguing phytochemical nature and biological activities. When it comes to the phytochemical profile of the roots of Iris albicans, the references in the global bibliography are scarce and even less when it comes to the possible anti-proliferative activity of the secondary metabolites deriving from the roots of said plant. The purpose of this research was the phytochemical study of the roots of I.albicans, the isolation and identification of its secondary metabolites and finding out if they have an anti-proliferative action vs six specific breast cancer cell lines.
More specifically the plant material was gathered, split in, underground (Roots)) and aboveground (Leaves and stems) parts which were powdered and subjected to extensive extractions with a series of different polarity solvents. On the basis of the evaluation of the TLC and 1H NMR profile of the produced extracts, the ethyl acetate extract of the roots (EtOAc-Roots) was selected for further investigation. The above extract was fractionated via liquid chromatography under vacuum (VLC) which, after appropriate poolings, produced 13 fractions that were split according to their chemical content of either (a) medium to high polarity fractions rich in phenolic secondary metabolites (mainly isoflavones and phenols) and (b) low to medium polarity fractions rich in terpenoids (mainly sterols and Iridals). It was decided that certain fractions would undergo additional fractionation with modern analytical technique of high-pressure liquid chromatography (HPLC). Out of the fractions that were rich in phenolic compounds, Fractions 12 and 13 were singled out after their evaluation with 1H NMR. Through the process of reverse phase HPLC, 8 compounds were isolated from which 6 are isoflavones, 1 is a bis-phenolic derivative and 1 is a benzoic derivative. Respectively, from the fractions that were rich in terpene compounds, fraction 4 was chosen for further investigation. The above-mentioned fraction was processed through normal phase (NP) HPLC, 2 compounds were isolated, as a mixture, both of which belong to the phytosterol category. Besides the 2 phytosterols several chemical mixtures of terpenes were that contained 2 or more Iridals were isolated that belong to the triterpene chemical category. All of the secondary metabolites that were isolated were identified through the use of one- and two-dimension nuclear magnetic resonance (NMR) and mass spectrometry HRESI- (-) MS. Finally, all the chemical compounds including the Iridal mixtures were tested in various chemical concentrations, for their anti-proliferative bioactivity against 6 breast cancer cell lines.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
