H βιομάζα, η οποία βρίσκεται σε αφθονία στην φύση, μπορεί να αποτελέσει μια εναλλακτική πηγή ενέργειας, απέναντι στην όλο και εντεινόμενη κατανάλωση των ορυκτών καυσίμων και των προβλημάτων που προκύπτουν από αυτήν. Η λιγνινοκυτταρινούχα βιομάζα, η οποία αποτελεί το μεγαλύτερο ποσοστό της βιομάζας, είναι φυτικής προελεύσεως και χρησιμοποιείται για την παραγωγή βιοκαυσίμων 2ης γενιάς. Αποτελείται κυρίως από κυτταρίνη, ημικυτταρίνες και λιγνίνη και άλλα συστατικά σε μικρότερες ποσότητες, τα οποία συγκροτούν μια σύνθετη δομή, ανθεκτική στην ενζυμική αποικοδόμηση. Η αξιοποίηση της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας για την παραγωγή βιοκαυσίμων, όπως η βιοαιθανόλη, απαιτεί κάποια στάδια επεξεργασίας, τα οποία στοχεύουν στην αλλαγή της φυσικοχημικής δομής της, διευκολύνοντας την αξιοποίηση των πολυσακχαριτών που υπάρχουν σε αυτήν, ως πηγές άνθρακα.
Το βακτήριο Zymomonas mobilis είναι ένας προαιρετικά αναερόβιος οργανισμός, ο οποίος έχει κεντρίσει το επιστημονικό ενδιαφέρον, λόγω της εξαιρετικής ικανότητας του να παράγει αιθανόλη μεταβολίζοντας βιομάζα. Με αφετηρία προηγούμενες ερευνητικές προσπάθειες, στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε προσπάθεια εισαγωγής των απαραίτητων γονιδίων για τον καταβολισμό ξυλόζης και αραβινόζης, πεντοζών που βρίσκονται σε μεγάλο ποσοστό στην λιγνινοκυτταρινούχα βιομάζα, σε έναν φορέα σταθερό στο βακτήριο. Λαμβάνοντας υπόψιν πρωταρχικά πειράματα για την σταθερότητα του φορέα pZB301 στα πλαίσια ερευνητικού προγράμματος, πραγματοποιήθηκε σε πρώτο στάδιο έλεγχος της σταθερότητας και αυτονομίας του στο στέλεχος Z. mobilis CP4. Ο φορέας pZB301, κατασκευάστηκε από το εργαστήριο της M. Zhang και παρελήφθη από το US Department of Energy - National Renewable Energy Laboratory και περιέχει τα γονίδια xylA (ισομεράση D-ξυλόζης) και xylB (ξυλοκινάση), καθώς και το οπερόνιο araBAD (L-ριβουλοκινάση, ισομεράση L-αραβινόζης, και L-5 φωσφό-ριβουλόζη-4 επιμεράση) από το E. coli, υπό τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου gap (αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής γλυκεριναλδεΰδης) του Z. mobilis και τα γονίδια tal (τρανσαλδολάση) και tkt (τρανσκετολάση) από το E. coli, υπό τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου eno (ενολάση) του Z. mobilis. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν πως ο φορέας δεν διατηρείται σταθερός εντός των κυττάρων του Ζ. mobilis CP4. Στην συνέχεια, πραγματοποιήθηκαν βήματα για κλωνοποίηση των γονιδίων xylA, xylB, araBAD, tal και tkt, παρμένα ως μήτρα από τον φορέα pZB301 μαζί με τους υποκινητές τους, στον φορέα pJADΔAR, έναν σταθερό φορέα στο Z. mobilis, που έχει κατασκευαστεί στο εργαστήριο της κας Παππά. Οι κασέτες PgapxylAxylB και Penotaltkt κλωνοποιήθηκαν επιτυχώς στον φορέα pJADΔAR και επιβεβαιώθηκαν μοριακά, ενώ πραγματοποιούνται προσπάθειες για την κλωνοποίηση της κασέτας PgaparaBAD. Επόμενο βήμα ήταν η εισαγωγή του φορέα pPS2.2, που περιείχε τις κασέτες PgapxylAxylB και Penotaltkt, στο στέλεχος Z. mobilis CP4, ενώ ακολούθησαν πειράματα σταθερότητας και αυτονομίας. Τα πειράματα έδειξαν πως ο φορέας pPS2.2 είναι εξαιρετικά σταθερός στο Z. mobilis. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα ελέγχου της ικανότητας των 3 επιβεβαιωμένων μοριακά στελεχών που φέρουν τον φορέα pPS2.2, να αναπτύσσονται σε υποστρώματα ξυλόζης ως πηγή άνθρακα. Τα πρώτα διερευνητικά αποτελέσματα, έδειξαν ικανότητα καταβολισμού ξυλόζης ως υπόστρωμα.
Τέλος, μετά από in silico ανάλυση, αποφασίστηκε η εισαγωγή των ετερόλογων γονιδίων μεταφορέων ξυλόζης και αραβινόζης xylFGH και araE αντίστοιχα, από το χρωμόσωμα του E.coli, στον φορέα pPS2.2. Ως πρώτο βήμα, πραγματοποιήθηκε ενίσχυση μέσω PCR του υποκινητή της ενολάσης (Peno), παρμένος ως μήτρα από το pZB301 και κλωνοποίηση του στον φορέα pJADΔAR (φορέας pPS3.1), ώστε σε επόμενα στάδια να πραγματοποιηθεί κλωνοποίηση των γονιδίων μεταφορέων xylFGH και araE, τα οποία θα βρίσκονται υπό τον έλεγχο του.
(EL)
Biomass, an abundant resource in nature, can become an alternative source of energy, against the increasing fossil fuel consumption and the dangers arising from their use. Lignocellulosic biomass, a plant or plant-based material, accounts for a major portion of the terrestrial biomass, can be used as raw material for 2nd generation biofuels production, especially bioethanol. Interwoven masses of cellulose, hemicelluloses and lignin, along with smaller amounts of other substances are the main components of lignocellulosic biomass. With regard to lignocellulosic biomass valorisation, it should undergo pretreatment processes, in order to become suitable for conversion into transportation fuels and value-added co-products.
Zymomonas mobilis, a facultative anaerobic bacterium, has garnered research interest, for its unique metabolic ability to produce ethanol fermenting sugars existing in biomass. Taking into consideration previous studies, we tried inserting necessary genes for xylose and arabinose fermentation, in a stable in Z. mobilis plasmid, in order to expand its metabolism. Taking into account previous research results, pZB301 plasmid stability was tested in Z. mobilis strain CP4. The plasmid pZB301, was given to our laboratory by US Department of Energy - National Renewable Energy Laboratory, in collaboration with the laboratory of M. Zhang and carries all the necessary genes for xylose and arabinose metabolism. Those genes are encoding for: xylose isomerase (xylA), xylokinase (xylB), ribulokinase (araB), L-arabinose isomerase (araA), L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase (araD), organized in the araBAD operon and transaldolase (talB) and transketolase (tktA). It was observed that pZB301 is not stable in Ζ. mobilis strain CP4. An attempt of inserting operons PgapxylAxylB, Penotaltkt and PgaparaBAD from pZB301, in pJADΔAR plasmid, a stable in Z. mobilis plasmid, which was constructed in our lab, was made. The two operons PgapxylAxylB and Penotaltkt were cloned successfully in pJADΔAR and verified using a restriction digest analysis, while attempts to clone operon PgaparaBAD are being made. Next step was to insert vector pPS2.2, carrying the two operons PgapxylAxylB and Penotaltkt, in Z. mobilis strain CP4, while experiments conducted to transformed colonies, to verify its stability. Results revealed that pPS2.2 vector is stable in Z. mobilis strain CP4. In parallel, the ability of 3 verified with restriction digestion, transformed strains to grow on xylose substrates was tested. Results indicated, that these strains could successfully ferment xylose as carbon source.
Finally, after in silico research, xylFGH and araE transporters genes insertion from E. coli chromosome, in plasmid pPS2.2 was decided, in order to enhance xylose utilisation abilities. The promoter Peno (promoter of the gene which encodes enolase in Z. mobilis) has been PCR-amplified and cloned in plasmid pJADΔAR (plasmid pPS3.1), in order to regulate xylFGH and araE transporters genes expression.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
