Η νόσος COVID – 19 είναι μια νέα ασθένεια που προκαλείται από τον ιό SARS-CoV – 2. Από την αρχή του 2020 έγινε μια από τις μεγαλύτερες προκλήσεις της εποχής μας, καθώς προκαλεί αρκετά συχνά σοβαρή πνευμονία ενώ μπορεί να οδηγήσει σε σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσφορίας (ARDS), ανεπάρκεια οργάνων και θάνατο. Κύριο χαρακτηριστικό της παθοφυσιολογίας της νόσου είναι η ανοσολογική απόκριση του ξενιστή καθώς αυτή διαφοροποιείται μεταξύ των ασθενών, οι οποίοι μπορεί να εμφανίσουν ελαφριά ή βαριά συμπτώματα. Ταυτόχρονα, η ασθένεια χαρακτηρίζεται από συστηματική απορρύθμιση του μεταβολισμού και εκτεταμένες αλλαγές στο λιπιδίωμα υποδηλώνοντας την πιθανότητα απορρύθμισης την λιπιδικών μεσολαβητών της φλεγμονής. Λίγες πρόσφατες μελέτες έχουν υποστηρίξει πως υπάρχει ανισορροπία στους λιπιδικούς μεσολαβητές με μια ταχεία αύξηση των προ-φλεγμονωδών μεσολαβητών που μπορεί να συμβάλλει στην σοβαρότητα της ασθένειας. Αν και οι λιπιδικοί μεσολαβητές βιοσυντίθενται γρήγορα μέσα σε δευτερόλεπτα έως και λίγα λεπτά σε περιπτώσεις οξείας φλεγμονής, συχνά παραμελούνται λόγω έλλειψης μεθοδολογιών για τον ποσοτικό προσδιορισμό τους.
Σε καταστάσεις παρατεταμένης οξείας φλεγμονής που χαρακτηρίζεται από υπερδιέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος, όπως στην περίπτωση της σοβαρής νόσου COVID – 19, είναι σημαντικό να μελετηθούν τα επίπεδα των λιπιδικών μεσολαβητών, οι οποίοι παίζουν κυρίαρχο ρόλο στην ενορχήστρωση των υπόλοιπων βημάτων της έμφυτης ανοσίας.
Στην παρούσα διπλωματική εργασία αναπτύχθηκε μια ευαίσθητη και αποτελεσματική βιοαναλυτική μέθοδος προσδιορισμού των λιπιδικών μεσολαβητών: 20-υδροξυ-εικοσιτετραενικού οξέος (20-ΗΕΤΕ), 11,12-εποξυ-εικοσατριενικού οξέος (11,12-ΕΕΤ) και 5(S)-6(R)-διυδροξυ-εικοσατετραενικού οξέος (5(S)-6(R)-DIHETE) σε πλάσμα ανθρώπινης προέλευσης με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας συζευγμένη με διαδοχική φασματομετρία μαζών (LC-MS/MS). Για την κατεργασία των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε πρώτα κατακρίμνηση πρωτεϊνών και στην συνέχεια ακολούθησε πρωτόκολλο εκχύλισης στερεής φάσης.
Η μέθοδος επικυρώθηκε πλήρως σύμφωνα με τις οδηγίες του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Φαρμάκων. Στην συνέχεια η μέθοδος εφαρμόστηκε για ανάλυση κλινικών δειγμάτων. Αναλύθηκαν συνολικά 110 δείγματα ασθενών. Τα χαμηλότερα όρια ποσοτικοποίησης (LLOQ) ήταν 0.25 ng/mL και για τους 3 αναλύτες. Τα ευρήματα της ανάλυσης, συσχετίζουν το 20-ΗΕΤΕ ως πιθανό παράγοντα κινδύνου για τη νοσηλεία των ασθενών σε μονάδα εντατικής θεραπείας, ανεξάρτητα από τον εάν οι ασθενείς είναι εμβολιασμένοι ή όχι.
Η συσχέτιση που προκύπτει είναι αρκετά σημαντική για το προαναφερθέν μόριο και τον κίνδυνο για νοσηλεία, καθώς το καθιστά έναν ισχυρό βιοδείκτη ο οποίος δύναται να εφοδιάσει τους κλινικούς γιατρούς με σημαντικές πληροφορίες για την εξέλιξη των ασθενών τους, σε αρκετά πρώιμο στάδιο της νόσου. Ταυτόχρονα, διακρίνοντας τον σημαντικό ρόλο του 20-HETE σχετικά με την σοβαρότητα της νόσου Covid-19, είναι πολύ πιθανό το συγκεκριμένο μόριο να αποτελέσει έναν μελλοντικό φαρμακολογικό στόχο για αυτή ή και άλλες ασθένειες με αντίστοιχη παθοφυσιολογία.
(EL)
The disease COVID – 19 is a new disease caused by the virus SARS-CoV – 2. Since the beginning of 2020, it has become one of the biggest challenges of our time, as it quite often causes severe pneumonia and can lead to acute respiratory distress syndrome (ARDS), organ failure and death. The main feature of the pathophysiology of the disease is the immune response of the host. The disease is also characterized by a systemic dysregulation of lipid metabolism and extensive changes in the lipidome suggesting the possibility of dysregulation of lipid mediators of inflammation. A few recent studies have suggested that there is an imbalance in lipid mediators with a rapid increase in pro-inflammatory mediators that may contribute to disease severity. Although lipid mediators are rapidly biosynthesized within seconds to minutes in acute inflammation, they are often neglected due to a lack of methodologies for their quantification.
In the case of a prolonged acute inflammation characterized by hyper stimulation of the immune system, as in the case of severe disease COVID–19, it is important to study the levels of lipid mediators, which play a dominant role in orchestrating the remaining steps of innate immunity.
In this thesis, a sensitive and efficient bioanalytical method was developed for the determination of the lipid mediators: 20-hydroxy-eicostetraenoic acid (20-HETE), 11,12-epoxy-eicosatrienoic acid (11,12-EET) and 5(S)-6(R)-dihydroxy-eicosatetraenoic acid (5(S)-6(R)-DIHETE) in human plasma using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). For the processing of the samples, protein determination was first performed and then followed by a solid phase extraction protocol.
The method was fully validated according to the guidelines of the European Medicines Agency (EMA). Then, a total of 110 patient samples were analyzed. The lower limits of quantification (LLOQ) were 0.25 ng/mL for all three analytes. The findings of the analysis suggest 20-HETE as a potential risk factor for intensive care unit admission (ICU), regardless of whether patients are vaccinated or not.
The resulting correlation between the levels of 20-HETE and the risk of ICU admission is quite important, as it makes it a powerful biomarker that can provide important information to doctors about the progression of the disease at a fairly early stage. At the same time, distinguishing the important role of 20-HETE regarding the severity of the Covid-19 disease, it is very possible that this specific molecule will be a future pharmacological target for Covid-19 or other diseases.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
