Εισαγωγή
Η πιο συχνή μονογονιδιακή αιτία κληρονομούμενης νευροαναπτυξιακής διαταραχής είναι το Σύνδρομο Ευθραύστου Χ (FXS). Στα άτομα που πάσχουν από το FXS, βρέθηκε στην 5’ αμετάφραστη περιοχή του εξονίου 1, του γονιδίου FMR1, μια μη φυσιολογική επέκταση του αριθμού επαναλήψεων της τρινουκλεοτιδικής αλληλουχίας CGG. Αυτή η επέκταση οδηγεί σε μεθυλίωση, μεταγραφική αποσιώπηση και απουσία της κωδικοποιούσας πρωτεΐνης, FMRP. Βάσει των οδηγιών του Αμερικανικού Κολλεγίου Μαιευτήρων και Γυναικολόγων, η επαναλαμβανόμενη αλληλουχία CGG χωρίζεται σε 4 κατηγορίες, 1)στη φυσιολογική εικόνα, με εύρος επαναλήψεων CGG 5 – 44, 2)στη γκρίζα (ενδιάμεση) ζώνη, με εύρος επαναλήψεων CGG 45 – 54, 3)στην προμετάλλαξη, με εύρος επαναλήψεων CGG 55 – 200 και 4)στην πλήρη μετάλλαξη, με εύρος επαναλήψεων CGG > 200.
Σκοπός
Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να αναπτυχθεί μια «in house» μεθοδολογία, που θα επιτρέπει ταυτόχρονα τον υπολογισμό του αριθμού των επαναλήψεων CGG και την αναγνώριση του προτύπου μεθυλίωσης για το χαρακτηρισμό ως ενεργής, προ ή πλήρους μετάλλαξης FXS.
Μεθοδολογία
Μελετήθηκαν 22 δείγματα DNA από τα οποία 18 αφορούν θήλεα άτομα και 4 άρρενα. Η μελέτη έγινε με τη χρήση της μεθόδου PCR σε συνδυασμό με το περιοριστικό ένζυμο HhaI και ανάλυση θραυσμάτων (Fragment Analysis).
Αποτελέσματα
Για το Σύνδρομο Ευθραύστου Χ μελετήθηκαν συνολικά 21 άτομα, εκ των οποίων τα 17 είναι θήλεα φορείς επέκτασης της αλληλουχίας CGG του γονιδίου FMR1, είτε ως προς τη προμετάλλαξη είτε ως προς την πλήρη μετάλλαξη. Τα υπόλοιπα 4 άτομα είναι άρρενα, που τα 2 εμφανίζουν πλήρη μετάλλαξη με μωσαϊκισμό (συνύπαρξη προ και πλήρους μετάλλαξης) της αλληλουχίας CGG, το τρίτο είναι φορέας προμετάλλαξης μεταξύ 59 – 64 επαναλήψεων με μωσαϊκισμό στην αλληλουχία CGG, ενώ το τέταρτο είναι φυσιολογικό άτομο και χρησιμοποιείται ως δείγμα ελέγχου (control). ). Σε ότι αφορά το πρότυπο μεθυλίωσης υπήρξε δυνατότητα μελέτης αλλά με αξιόπιστα αποτελέσματα κυρίως στα αλληλόμορφα φυσιολογικού μεγέθους.
Συμπεράσματα
Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας έδειξαν πως το διαμορφωμένο πρωτόκολλο για το Σύνδρομο του Ευθραύστου Χ λειτούργησε καθώς μπόρεσε να μελετηθεί το πρότυπο μεθυλίωσης αλλά και να υπολογιστεί ο ακριβής αριθμός επαναλήψεων της αλληλουχίας CGG κάθε ασθενούς όσον αφορά τη «Γκρίζα Ζώνη» και την Προμετάλλαξη. Όσον αφορά το μέγεθος της Πλήρους Μετάλλαξης αυτό δεν είναι εφικτό να καταμετρηθεί μέσω των πρωτόκολλων που στηρίζονται σε PCR, όπως το συγκεκριμένο.
(EL)
Background
Fragile X Syndrome (FXS) is the most common monogenic cause of impaired neurodevelopment and it’s an X – linked disorder. In individuals with FXS, an abnormal expansion of the trinucleotide CGG repeats, located in the 5' untranslated region of exon 1 of the FMR1 gene, leads to methylation, transcriptional silencing and absence of the FMRP protein. Based on the American College of Obstetricians and Gynecologists guidelines, the CGG repeat sequence is categorized to: 1) normal pattern, with a CGG repeat range of 5 - 44, 2)gray (intermediate) zone, with a CGG repeat range of 45 - 54, 3)pre-mutation, with a CGG repeat range of 55 - 200, and 4)full mutation, with a CGG repeat range of > 200.
Purpose
The purpose of this thesis is to develop a preformulated “in – house” procedure to allow the simultaneous evaluation of CGG repeat especially in the range of the premutation and the methylation profile.
Methodology
Twenty-two DNA samples were studied, of which 18 were from females and 4 from males, and this study was performed using PCR method and restriction enzyme and fragment analysis.
Results
A total of 21 individuals were studied for Fragile X Syndrome, of whom 17 are female carriers with an expansion of CGG sequence of FMR1 gene, either in the range of premutation or full mutation. The remaining 4 individuals are males, with 2 carrying a mosaic pattern (co – existence of pre and full mutation), the third is a premutation carrier, ranging between 59 – 64 repeats of CGG sequence, while the fourth is a normal individual used as a control sample. Methylation profiling was feasible in the range of normal repeats.
Conclusions
The results of this study demonstrated that the “in house” protocol for Fragile X Syndrome could be applied in diagnosis, as it was able to simultaneously detect the methylation pattern and the number of CGG sequence repeats for each patient, regarding the “gray zone” and premutation. However, characterizing the full mutation is not feasible through PCR based protocols like this specific one.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
