Η Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία (ΟΛΛ) αποτελεί την συχνότερα εμφανιζόμενη μορφή καρκίνου στα παιδιά αντιπροσωπεύοντας το 28% των περιπτώσεων παγκοσμίως84. Η εμφάνιση της οφείλεται στον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό πρόδρομων λεμφοκυττάρων Β και Τ κυτταρικής σε διάφορα στάδια της ωρίμανσης τους και είναι αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης γενετικών και επιγενετικών παραγόντων. Η διάγνωση της νόσου έγκειται στην ανίχνευση λεμφοβλαστών άνω του 25% στον μυελό και στον ανοσοφαινοτυπικό, μορφολογικό και κυτταρογενετικό χαρακτηρισμό τους, προκειμένου να ταξινομηθούν οι ασθενείς σε ομάδες κινδύνου σύμφωνα με το μοριακό προφίλ της νόσου και να χορηγηθεί το κατάλληλο σχήμα θεραπείας54. Μεταξύ των διαφόρων μορφών ΟΛΛ, ο επικρατέστερος φαινότυπος είναι η Β-ΟΛΛ που προσβάλει πρόδρομες μορφές Β λεμφοκυττάρων και τα ποσοστά πενταετούς επιβίωσης ξεπερνούν το 90%177. Η θετική πρόγνωση των ασθενών της συγκεκριμένης ομάδας είναι απόρροια της βελτιστοποίησης των θεραπευτικών σχημάτων σε συνδυασμό με την κατανόηση της μοριακής βάσης της νόσου και του ενδελεχούς γενετικού χαρακτηρισμού των καρκινικών κυττάρων και τον προσδιορισμό του φαινοτύπου. Ωστόσο, τα ποσοστά επιβίωσης εμφανίζουν διακυμάνσεις σύμφωνα με την ηλικία των ασθενών, την παρουσία γενετικών ανωμαλιών και των κυττάρων που προσβάλλονται καθώς οι ασθενείς με Τ-ΟΛΛ παρουσιάζουν μια δυσμενή πρόγνωση83.
Με σκοπό να αποτραπεί η παρουσία ελάχιστης υπολειπόμενης νόσου, να αξιολογηθεί η απόκριση των ασθενών στα θεραπευτικά σχήματα και η εκτίμηση της πρόγνωσης τους να είναι όσον το δυνατόν πιο αντιπροσωπευτική κρίνεται αναγκαία η ανεύρεση νέων βιοδεικτών που αντανακλούν το καρκινικό φορτίο με υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία178. Με γνώμονα τις συγκεκριμένες παραμέτρους επιλέχθηκαν γονίδια που διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στην αιμοποίηση και τον κυτταρικό κύκλο όπως το IKZF1,ETV6, GATA-3 και CDKN2A, προκειμένου να μελετηθεί η πιθανή επίδραση που έχει παρουσία παραλλαγών στον αριθμό αντιγράφων τους στην εξέλιξη των ασθενών. Για την συγκριτική μελέτη της παρουσίας CNV στα εξεταζόμενα γονίδια επιλέχθηκε ως γονίδιο αναφοράς η λεπτίνη η οποία αναμένεται να παρουσιάζει σταθερή έκφραση μεταξύ φυσιολογικών και παθολογικών περιπτώσεων διατηρώντας τα ποσοστά διπλοειδίας179,180. Πιο συγκεκριμένα, σε δείγματα γενωμικού DNA που απομονώθηκαν από κύτταρα του μυελού των οστών ασθενών με ΟΛΛ που χορηγήθηκαν από το Νοσοκομείο Παίδων «Π. & Α. Κυριακού» όπου ακολουθείται το BMF-ALL πρωτόκολλο θεραπείας και έλαβε χώρα η ποσοτικοποίηση του αριθμού αντιγράφων των υπό μελέτη γονιδίων αξιοποιώντας την ποσοτική αντίδραση PCR μέσω σχετικού ποσοτικού προσδιορισμού.
Αφότου οι τιμές των κύκλων ενίσχυσης για τα γονίδια κανονικοποιήθηκαν ως προς το γονίδιο αναφοράς και το θετικό πρότυπο HeLa, οι τιμές που προέκυψαν συσχετίστηκαν μέσω του λογισμικού SPSS της IBM με τις κλινικοπαθολογικές παραμέτρους για την εκτίμηση της κλινικής τους σημασίας. Η συσχέτιση των τιμών υλοποιήθηκε μέσω κατηγορικής ανάλυσης όπου οι ασθενείς κατηγοριοποιήθηκαν στις ομάδες απώλειας και διπλοειδίας με ενισχύσεις, ενώ κατά την συνεχή μελέτη συγκρίθηκαν αυτούσιες οι τιμές RQ του σχετικού προσδιορισμού. Σύμφωνα με την δοκιμασία αξιολόγησης Kruskal-Wallis, κατά την συνεχή συσχέτιση αναδείχθηκε ο χαμηλός κίνδυνος υποτροπής των ασθενών που σημειώνουν απώλειες για τα γονίδια ETV6 και GATA-3. Ειδικότερα, το ETV6 υπέδειξε στατιστική σημαντικότητα ως προς την συσχέτιση του με την απάντηση του μυελού την 15 μέρα (p=0.017) και την απόκριση στην θεραπεία βάσει του αριθμού των λεμφοβλαστών ((p=0.031), όπου οι χαμηλότερες τιμές RQ ταυτίστηκαν με την ομάδα χαμηλού κινδύνου με απάντηση μυελού Μ1 και θετική απόκριση στην θεραπεία (<1000 βλάστες). Ομοίως, το GATA-3 έφερε στατιστική σημαντικότητα κατά την συσχέτιση του με την απάντηση του μυελού κατά την 15η μέρα, όπου οι χαμηλότερες τιμές RQ παρατηρήθηκαν για τους ασθενείς χαμηλού κινδύνου με απάντηση μυελού Μ1 (p=0.027).
Από την άλλη πλευρά, η κατηγορική ανάλυση υποστηρίζει πως οι ασθενείς που σημειώνουν απώλεια των γονιδίων IKZF1 και CDKN2A ενέχουν υψηλό κίνδυνο υποτροπής με στατιστική σημαντικότητα. Πιο συγκεκριμένα, οι διαγραφές στο IKZF1 κυριαρχούν για τους ασθενείς υψηλού κινδύνου με απάντηση μυελού Μ3 κατά την 15η μέρα (p<0.001) και με ανιχνεύσιμη MRD κατά την 33η μέρα (p=0.017), καταδεικνύοντας την αρνητική προγνωστική ισχύ που επιφέρει η απώλεια του συγκεκριμένου γονιδίου. Στον αντίποδα το CDKN2A υπέδειξε διφορούμενα αποτελέσματα ως προς την παρουσία CNV, καθώς τόσο κατά την συνεχή μελέτη (p=0.039) όσο και κατά την κατηγορική ανάλυση (p=0.036) παρουσίασε στατιστικώς σημαντικά αποτελέσματα, με την ύπαρξη διαγραφών να είναι εντοπισμένη στους ασθενείς χαμηλού κινδύνου με απάντηση μυελού Μ1. H συγκεκριμένη διαπίστωση ενδεχομένως απορρέει από την επιλογή εξωνίου για το οποίο σχεδιάστηκαν οι εκκινητές καθώς και την αναστολή της έκφρασης του ογκοκατασταλτικού γονιδίου μέσω ενός εναλλακτικού μηχανισμού που εμπίπτει σε επιγενετικούς παράγοντες. Τέλος, αν και οι καμπύλες επιβίωσης δεν συνιστούν την ανεξάρτητη και μεμονωμένη αξιολόγηση των CNVs λόγω περιορισμένης στατιστικής ισχύος, το γονίδιο ΕΤV6 παρουσιάζει μια έντονη τάση για διαχωρισμό των ασθενών σύμφωνα με τον αριθμό αντιγράφων τους τόσο στην καμπύλη ολικής επιβίωσης ολικής επιβίωσης OS (HR:30,332; 95% CI: 0.041-22,690.968;p=0.099, long-rank: p=0.099) και όσο και στην καμπύλη άνευ εξέλιξης της νόσου PFS (HR:30.636; 95%CI:0.060-15,582.910; p=0.079,long-rank p=0.078). Επιπλέον, παρατηρείται τάση διαχωρισμού χωρίς στατιστικώς σημαντικό αποτέλεσμα για την καμπύλη ολικής επιβίωσης στο GATA3 (HR:2.661; 95%CI: 0.333-21.280;p=0.337;long-rank p=0.336), χωρίς την αντίστοιχη εικόνα να παρατηρείται στην καμπύλη PFS(HR:1.358; 95%CI:0.288-6.395;p=0.698; long-rank p=0.697).
Εκ κατακλείδι, αναμένεται πως η αύξηση του υπό εξέταση πληθυσμού θα ενισχύσει τα παρόντα δεδομένα και θα τροποποιήσει την στατιστική σημαντικότητα τους, ενώ η μεμονωμένη αξιολόγηση της παρουσίας διαγραφών σε ομόγυζη και ετερόζυγη διπλοειδία ίσως αξιοποιηθεί για την ταξινόμηση των ασθενών χαμηλού κινδύνου λόγω του υψηλού επιπολασμού που παρουσιάζει ο φαινότυπος με το υβριδικό μόριο ETV6-RUNX1 ο οποίος είναι συνυφασμένος με την παρουσία διαγραφών στο ETV6.
(EL)
Acute Lymphoblastic Leukemia represents the most frequent diagnosed form of cancer in children, constituting almost 28% of all pediatric malignancies worldwide. It is characterized from clonal expansion of lymphoid hematopoietic precursors, especially of B and T lymphocytes, which exhibit developmental arrest at varying stages of differentiation and is caused of the interaction between genetic and epigenetic factors. The diagnosis of chALL is mainly based on the detection of lymphoblast in bone marrow samples overlapping the 25% of them and the characterization of the blast according to their morphology, immunophenotype and the cytogenetic abnormalities to discriminate the patients in different risk groups and decide the most suitable treatment. Among the different forms of chALL, pre-B-ALL is the most common type of leukemia in children’s population affecting the precursor cells and is correlated to a good prognosis, while the overall survival rates surpass 90%. The promising progress of this group is directly related to the optimization of treatment protocols over the past few decades in combination with the understanding of the underlying molecular basis of the disease and the rigorous characterization of cancer cell’s genetic background. However, the survival rates vary according to the patient’s age, the profile of genetic abnormalities and the type of lymphoblast been affected, while the malignant clonal expansion of T lymphoblast has been associated with a dismissal prognosis.
Taking everything into consideration, the aim of this study is to predict the presence of minimal residual disease (MRD) promptly, evaluate patient’s response to treatment and provide a representative prognosis with clinical value, following up patients progress constantly in different stages of treatment and seeking for precising and reliable genetic biomarkers that reflect cancer’s burden. In terms of genetic locus, we decide to investigate the clinical value of CNVs in genes having an important role in hemopoiesis and cell cycle, such as IKZF1, ETV6, GATA-3 and CDKN2A, and associate the impact of contingent difference in their allele number on patient’s progress. The comparison between allele frequences was enabled by using the reference gene, LEP116, which is anticipated to present a stable transcription among healthy and nonhealthy individuals, retaining the percentage of diploid regardless of the examined carrier. In particular, the examination of CNV presence was carried out in 65 genomic DNA isolated from bone marrow cells, offered by “P. & A. Kyriakou” Children’s Hospital and treated according to BMF-ALL protocol, and the relative quantification of allele levels was based on quantitive PCR reaction.
After the levels of cycle extension was gathered, they were calibrated in comparison with the corresponding cycle values of reference gene and HeLa positive control and then, the calculated RQ levels was correlating with patient’s clinicopathologigal characteristics, using the IBM’s software SPSS. The correlation of CNV with those parameters was separated in two distinctive ways following the categorical classification of patient’s according to the allele levels in loss (Hypodiploid and Loss of Heterozygote) and diploid-amplified group, whereas the continuous study evaluated the RQ levels emerged from the reference curve. As a result of the last examination, Kruskal-Wallis test proved the positive prognostic value of ETV6 and GATA-3 losses founded in low risk group, while ETV6 was deleted with statistical significance in M1 BM response (p=0.017) and in low detected blast’s number (<1000, p=0.031) patients. Similarly, GATA-3 RQ levels were underrepresented with high statistical value in low-risk group having a M1 BM response on the 15th day (p=0.027).
On the contrary, the categorical study demonstrated the adverse clinical value of IKZF1 and CDKN2A deletions providing the high trend of relapse. More specifically, IKZF1 losses dominated in high-risk group diagnosed with M3 BM response on 15th day (p<0.001) and detective MRD levels on 33rd day (p=0.017). Meanwhile, CDKN2A allele levels had controversial results in respect to both analyses, taking into consideration that the lowest RQ levels (p=0.039) and as well as the group characterized by deletions in this gene (p=0.036) had a spike on the low-risk group with a M1 BM response. The debatable effect may have arisen from the exon gene for which primers were designed and the anticipated deregulation of this gene in the high-risk group could be explained from an alternative mechanism based on an epigenetic silence.
Concluding, the Kaplan-Meier curves of OS and PFS couldn’t reflect the statistical significance of the CNV consequences in patient’s progress in none of the examined genes. Though the limited clinical value, there is a trend of discrimination between categorical patient’s classification observed in GATA-3 and, especially in ETV6 CNV’s levels. Particularly, GATA-3 deletion showed a better clinical outcome for patient’s health in OS curve ((HR:2.661; 95%CI: 0.333-21.280;p=0.337;long-rank p=0.336), where the non-loss group’s survival probability was on the wane. In a superior way, ETV6 CNV’s evaluation displayed a highest differentiation rate and clinical efficacy in both OS (HR:30,332; 95% CI: 0.041-22,690.968;p=0.099, long-rank: p=0.099) and PFS (HR:30.636; 95%CI:0.060-15,582.910; p=0.079,long-rank p=0.078) curves, where losses in this gene are correlated with an extended survival. Taking everything into account, the absence of ETV6 and GATA-3 is related to a good prognosis while the corresponding losses of IKZF1 and CDKN2A show up an adverse effect on patient’s progress, if they are examined in comparison with gold standard markers. To achieve a better clinical significance and evaluate those markers separately, it is inevitable to increase patient population and investigate ETV6 losses singly so as to discriminate the already diagnosed as a good risk group.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
