Το Πλακώδες Καρκίνωμα Κεφαλής και Τραχήλου (HNSCC) αποτελεί μία από τις συχνότερες αιτίες
θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Παρά την σοβαρότητα της νόσου η διάγνωση δεν είναι
αποτελεσματική λόγω της έλλειψης στρατηγικών διαλογής με αποτέλεσμα οι περισσότεροι ασθενείς να διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια. Ο HNSCC αποτελεί μία ιδιαίτερα ετερογενή νόσο και η θεραπεία του απαιτεί επιθετικές προσεγγίσεις χειρουργικής επέμβασης και ακτινοθεραπείας με σοβαρές παρενέργειες και κακή ποιότητα ζωής για τους ασθενείς. Ως εκ τούτου είναι αναγκαίος ο άμεσος χαρακτηρισμός των μοριακών μονοπατιών που αφορούν τον HNSCC ώστε να καθιερωθεί αποτελεσματικότερη διάγνωση και θεραπεία. Η παρούσα εργασία επιχειρεί να διερευνήσει τα μοριακά μονοπάτια που χαρακτηρίζουν τον HNSCC μέσω της αξιολόγησης και κατηγοριοποίησης πλήθους δεδομένων ασθενών της βάσης TCGA, να αξιολογήσει την μέθοδο qPCR με TaqMan ανιχνευτές ως προς την ικανότητα ανίχνευσης παθολογικού αριθμού αντιγράφων και να εφαρμόσει το πρωτόκολλο σε ασθενείς HNSCC.
Αρχικά μελετήθηκε το γονίδιο CSMD1 (Chr8, p23.2), το οποίο σύμφωνα με προγενέστερες μελέτες
υφίσταται μειωμένη έκφραση, μεταλλάξεις και μεθυλιώσεις σε διάφορους τύπους καρκίνου,
θεωρείται υποψήφιο ογκοκατασταλτικό γονίδιο, ενώ μελετάται στον HNSCC κυρίως ως προς την
αλλαγή του αριθμού αντιγράφων. Στην παρούσα μελέτη αναλύθηκαν δεδομένα της βάσης TCGA για πλήθος ειδών καρκίνου ως προς τη συχνότητα της παρουσίας γονιδιακών απαλοιφών στο γονίδιο CSMD1. Παρατηρήθηκε ότι ο HNSCC φέρει το υψηλότερο ποσοστό διαγραφών στο γονίδιο αυτό με διαγραφές στο 22,63% των ασθενών. Λαμβάνοντας υπόψη την συχνή παρουσία απαλοιφών στην περιοχή 8p πολλά είδη καρκίνου κρίθηκε χρήσιμο να μελετηθεί μεγαλύτερη έκταση του χρωμοσώματος 8 γύρω από το γονίδιο CSMD1 με σκοπό να αξιολογηθούν πιθανές διαγραφές και σε άλλα γονίδια στην περιοχή 8p23.3 με 8p12. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση 496 δειγμάτων ασθενών με HNSCC από το TCGA ως προς την παρουσία απαλοιφών στην περιοχή αυτή. Παρατηρήθηκε η πολύ αυξημένη παρουσία διαγραφών στο γονίδιο CSMD1 σε σχέση με οποιοδήποτε άλλο γονίδιο καθώς και η σταδιακή μείωση των διαγραφών στα δείγματα μετά την περιοχή του γονιδίου CSMD1 (p23.2) προς την περιοχή p12. Τα δεδομένα αυτά χρησιμοποιήθηκαν για την κατηγοριοποίηση των ασθενών σε υποομάδες που εμφανίζουν κοινά μοτίβα απαλοιφών. Οι ασθενείς που έφεραν απαλοιφή μόνο στο γονίδιο CSMD1 (ομάδα ONLY CSMD1 DELETED), που έφεραν απαλοιφές σε γονίδια της περιοχής p23.3 - p23.1 του χρωμοσώματος 8 (ομάδα p23.3 - p23.1 DELETED) και που δεν έφεραν απαλοιφές (ομάδα NOT DELETED) μελετήθηκαν περεταίρω, αξιοποιώντας τα εργαλεία σύγκρισης μοριακών χαρακτηριστικών που παρέχει η πλατφόρμα cBioPortal, ως προς την παρουσία μεταλλαγών στα
γονίδια BRCA2, RAD52, ATM και BRCA1 που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση με ομόλογο
ανασυνδιασμό καθώς και στα γονίδια HRAS, SOS2, SOS1, BRAF που σχετίζονται με το μοριακό
μονοπάτι RAS. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ομάδα ασθενών ONLY CSMD1 DELETED έχει σαφώς αυξημένα ποσοστά μεταλλαγών στα γονίδια που συμμετέχουν στην επιδιόρθωση με ομόλογο ανασυνδιασμό σε σχέση με τις άλλες ομάδες. Οι μεγαλύτερες διαφορές σημειώθηκαν στα γονίδια BRCA2 και RAD52 με στατιστικώς σημαντική διαφορά από τις άλλες ομάδες. Σχετικά με το μοριακό μονοπάτι RAS παρατηρήθηκε ότι η ομάδα ασθενών p23.3 - p23.1 DELETED έδειξε αυξημένη συχνότητα μεταλλαγών στα γονίδια που μελετήθηκαν σε σχέση με τις άλλες δύο ομάδες με σημαντικότερες τις διαφορές στα γονίδια HRAS και SOS2. Συνολικά μέσω της μετα-ανάλυσης δεδομένων ασθενών της βάσης TCGA προέκυψε το συμπέρασμα ότι πιθανόν διαφορετικοί βιολογικοί μηχανισμοί συνδέονται με διαφορετικά προφίλ απαλοιφών στην συγκεκριμένη χρωμοσωμική περιοχή. Οι ασθενείς που έφεραν στοχευμένη απαλοιφή μόνο στο γονίδιο CSMD1 έδειξαν αυξημένη μεταλλαξιμότητα σε γονίδια του ομόλογου ανασυνδιασμού ενώ οι ασθενείς με εκτεταμένες απαλοιφές στο άκρο του βραχίονα 8p έδειξαν αυξημένες μεταλλαγές σε γονίδια που εμπλέκονται στο μοριακό μονοπάτι HRAS.
Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (qPCR) με TaqMan ανιχνευτές για την ανίχνευση αλλαγών στον αριθμό αντιγράφων (CNAs). Επιλέχθηκαν assays για τον εντοπισμό του αριθμού αντιγράφων των γονιδίων DLGAP2, CSMD1, PINX1 της περιοχής p23.3 - p23.1 του χρωμοσώματος 8 και πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση της μεθόδου για τον προσδιορισμό των CNAs σε πλήθος καρκινικών κυτταρικών σειρών που διέθεταν δεδομένα για την παρουσία ή απουσία απαλοιφών από κλινικές μελέτες στην πλατφόρμα cBioPortal. Αναλύθηκαν οι καρκινικές κυτταρικές σειρές DLD1, A549, HCT116, BB49, SKMEL28, SKOV3 με απουσία απαλοιφών στο 8p, οι CAL33, RT112, SCC25, PC3 με παρουσία απαλοιφών στα γονίδια DLGAP2, CSMD1, PINX1 και οι TCCSUP, A375, SF268 με παρουσία απαλοιφών μόνο στο γονίδιο CSMD1. Παρατηρήθηκε ότι οι διαφορές των τιμών των κυτταρικών σειρών με απαλοιφές βρέθηκαν στατιστικώς σημαντικά μικρότερες από τις τιμές των κυτταρικών σειρών με φυσιολογικό αριθμό αντιγράφων και για τα τρία γονίδια ενδιαφέροντος. Το γεγονός αυτό αποδεικνύει ότι σε όλες τις περιπτώσεις η μέθοδος πέτυχε τον αποτελεσματικό εντοπισμό των απαλοιφών και τον διαχωρισμό από τα δείγματα με φυσιολογικό αριθμό αντιγράφων.
Ακολούθησε η εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα ασθενών που έφεραν γνωστές μεταλλαγές στα
γονίδια BRCA1, BRCA2, ATM, RAD50, BLM που εμπλέκονται στον ομόλογο ανασυνδιασμό καθώς και διαφορετικές μεταλλάξεις στο γονίδιο HRAS. Συνολικά αναλύθηκαν δώδεκα δείγματα ασθενών με έξι ασθενείς για κάθε μια από τις παραπάνω κατηγορίες. Η χρήση της μεθόδου έδειξε και στις δύο περιπτώσεις ότι ένας στους έξι ασθενείς έφερε στοχευμένη απαλοιφή στο CSMD1 στην περίπτωση των ασθενών με μεταλλαγές στον ομόλογο ανασυνδιασμό ή απαλοιφές στα τρία γονίδια DLGAP2, CSMD1, PINX1 στην περίπτωση ασθενών με μεταλλαγές στο HRAS. Το αποτέλεσμα αυτό συνάδει με τα ευρήματα της μετα-ανάλυσης δεδομένων από το TCGA και πιθανόν αποκαλύπτει μια βιολογική σύνδεση μεταξύ της παρουσίας μεταλλαγών στα γονίδια του ομόλογου ανασυνδιασμού ή του μοριακού μονοπατιού HRAS και της δημιουργίας συγκεκριμένου προφίλ απαλοιφών στο 8p. Για την εγκυρότητα των ευρημάτων επιβάλλεται η μελλοντική εφαρμογή της μεθόδου σε μεγαλύτερο εύρος δειγμάτων. Η κατανόηση των μοριακών μονοπατιών που χαρακτηρίζουν τον HNSCC και η κατηγοριοποίηση των ασθενών με βάση τα μοναδικά μοριακά χαρακτηριστικά τους μπορεί να επιτρέψει την έγκαιρη και ακριβή διάγνωση και την προσαρμογή των θεραπευτικών παρεμβάσεων ώστε να ανταποκρίνονται στα συγκεκριμένα μοριακά προφίλ των ασθενών. Τέτοιες στοχευμένες θεραπείες υπόσχονται αυξημένη αποτελεσματικότητα με λιγότερες παρενέργειες, βελτιστοποιώντας τη θεραπευτική ανταπόκριση.
(EL)
Head and Neck Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) is one of the most common causes of cancer deaths worldwide. Despite the severity of the disease, diagnosis is not effective due to the lack of screening strategies, resulting in most patients being diagnosed at advanced stages. HNSCC is a highly heterogeneous disease and its treatment requires aggressive surgical and radiotherapy approaches with severe side effects for patients. Therefore, there is a need to characterize the molecular pathways involved in HNSCC in order to establish more effective diagnosis and treatment. This study attempts to investigate the molecular pathways characterizing HNSCC through the evaluation and categorization of a large number of patient data from the TCGA database, to evaluate the qPCR method with TaqMan probes for detecting abnormal gene copy numbers and to apply this protocol to HNSCC samples.
The CSMD1 gene (Chr8, p23.2), according to previous studies undergoes reduced expression,
mutations and methylation in various cancer types. It is considered a candidate tumor suppressor
gene and is being studied in HNSCC mostly about copy number alteration. In this study, TCGA database data for numerous cancer types were analyzed for detecting deletions in CSMD1 gene. It was observed that HNSCC presents the highest percentage of deletions in this gene (22.63%). Considering the frequent presence of deletions in the 8p region in many cancers, it was chosen to study a larger area of chromosome 8 around CSMD1 gene in order to evaluate possible deletions in other genes in the 8p23.3- 8p12 region. Analysis of 496 samples of HNSCC patients from TCGA was performed for the detection of deletions in this region. It was observed that CSMD1 gene shows the highest deletions percentage when compared to any other gene in this region. Α gradual decrease of deletions after CSMD1 gene region (p23.2) towards the p12 region was also remarkable. These data were used to categorize patients into subgroups showing common deletion patterns. The group of patients with deletions only in CSMD1 gene (ONLY CSMD1 DELETED group), the group with deletions in genes of the p23.3 - p23.1 region of chromosome 8 (p23.3 - p23. 1 DELETED group) and the group without deletions (NOT DELETED group) were further studied, using the molecular characterization comparison tools provided by the cBioPortal platform. The groups of patients were analyzed for the presence of mutations in BRCA2, RAD52, ATM and BRCA1 genes, involved in homologous recombination repair as well as in HRAS, SOS2, SOS1, BRAF genes, associated with the HRAS molecular pathway. The results showed that the ONLY CSMD1 DELETED group of patients had clearly increased mutation rates in genes involved in homologous recombination repair compared to the other groups. BRCA2 and RAD52 genes showed statistically significant differences compared to the other groups. Regarding the HRAS molecular pathway, it was observed that the p23.3 - p23.1 DELETED group of patients showed increased frequency of mutations compared to the other two groups. The most significant differences were shown to HRAS and SOS2 genes. Overall, through the meta-analysis of patient data from the TCGA database it was concluded that probably different biological mechanisms are associated with different deletion profiles in this chromosomal region. Patients with targeted deletion only in CSMD1 gene showed increased presence of mutations in homologous recombination genes while patients with extensive deletions at 8p arm showed increased mutations in genes involved in the HRAS molecular pathway.
Quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) was evaluated using TaqMan probes to
detect copy number alterations (CNAs). Assays were selected to detect copy numbers of DLGAP2,
CSMD1 and PINX1 genes of the p23.3 - p23.1 region of chromosome 8. An evaluation of this method
was performed to identify CNAs in cancer cell lines with available data from clinical studies on
cBioPortal platform about the presence of deletions in these genes. Cancer cell lines DLD1, A549,
HCT116, BB49, SKMEL28, SKOV3 without deletions at 8p, CAL33, RT112, SCC25, PC3 with deletions in
DLGAP2, CSMD1, PINX1 genes and TCCSUP, A375, SF268 with deletions only in CSMD1 gene were
analyzed. It was observed that the copy numbers of cell lines with deletions were found to be
statistically significantly smaller than the ones of cell lines with normal copy number for all the three
genes of interest. This fact demonstrates that in all cases the method was successful in effectively
detecting gene deletions in this area and separating them from the samples with normal gene copy
numbers. The method was applied to samples of HNSCC patients with known mutations in BRCA1, BRCA2, ATM, RAD50, BLM genes involved in homologous recombination as well as different mutations in HRAS gene. A total of twelve patient samples were analyzed, six patients for each of the above categories. The method showed in both cases that one out of six patients had targeted deletion in CSMD1 in the case of patients with mutations in homologous recombination or deletions in all three genes DLGAP2, CSMD1, PINX1 in the case of patients with mutations in the HRAS pathway. This result is consistent with the findings of the meta-analysis of data from TCGA and potentially reveals a biological link between the presence of mutations in homologous recombination or HRAS molecular pathway genes and the generation of a specific deletion profile at 8p. Future application of the method to a wider range of samples is required for more valid results. Understanding the molecular pathways that characterize HNSCC and categorizing patients based on their unique molecular characteristics may allow early and accurate diagnosis and personalized therapeutic interventions to respond to patients' specific molecular profiles.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
