Ο καρκίνος του μαστού (Breast Cancer, BrCa) είναι η πιο συχνή μορφή καρκίνου στις γυναίκες, παγκοσμίως. Παρ’ όλο που αποτελεί μια τόσο συχνή και σοβαρή κακοήθεια, τα επιτεύγματα της σύγχρονης κλινικής και φαρμακευτικής ογκολογίας την καθιστούν ιάσιμη και στην πλειονότητα των περιπτώσεων, εφόσον όμως διαγνωστεί εγκαίρως. Η εμφάνιση της νόσου σχετίζεται συνήθως με τον συνδυασμό γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων, ενώ μπορεί να ταξινομηθεί σε σποραδικό, οικογενή ή κληρονομικό καρκίνο του μαστού. Ο BrCa αναπτύσσεται κυρίως στους λοβούς και στους γαλακτοφόρους πόρους των μαστών και είναι μια συστηματική νόσος που μπορεί να εξαπλωθεί σε όλο το σώμα. Κάθε υπότυπος παρουσιάζει μεγάλη ετερογένεια σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο, με διακριτά παθολογικά χαρακτηριστικά και κλινικά αποτελέσματα, επηρεάζοντας τον σχεδιασμό και την επιλογή της θεραπείας. Η χρήση του προσυμπτωματικού ελέγχου, κυρίως της μαστογραφίας, και η ένταξή του στην ετήσια κλινική ρουτίνα γυναικών άνω των 40 ετών, έχει οδηγήσει στην έγκαιρη διάγνωση και καλύτερη αντιμετώπιση ασθενών. Ακόμα και σήμερα, η «gold standard» μέθοδος διάγνωσης είναι η βιοψία, η οποία δίνει σημαντικές πληροφορίες για τον τύπο του όγκου και την επιλογή της κατάλληλης θεραπείας.
Η εξέλιξη του καρκίνου του μαστού συνδέεται κυρίως με δύο καλά χαρακτηρισμένες οδούς: το προφίλ έκφρασης διαφόρων υποδοχέων (όπως οιστρογονικοί υποδοχείς, υποδοχείς προγεστερόνης και υποδοχείς επιδερμικού αυξητικού παράγοντα) και τον βαθμό και πολλαπλασιασμό του όγκου. Οι τρεις κύριοι υπότυποι καρκίνου μαστού είναι: α) θετικός για υποδοχείς ορμονών οιστρογόνων και προγεστερόνης (ER+ ή PR+), β) με υπερέκφραση του ογκογονιδίου ERBB2 (HER2+), και γ) τριπλά αρνητικός καρκίνος του μαστού (TNBC) (ER-, PR-, HER2-). Παρότι δεν έχει γίνει πλήρως κατανοητός ο μηχανισμός ογκογένεσης, φαίνεται ότι μπορεί να προκληθεί από στεροειδείς ορμόνες του φύλου, μεταλλάξεις σε ογκογονίδια (π.χ. EGFR, ERBB2) και απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (π.χ. BRCA1, BRCA2). Με τον προσδιορισμό καρκινικών βιοδεικτών στα βιολογικά υλικά μπορεί να ληφθούν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την διάγνωση, την πρόγνωση καθώς και την παρακολούθηση θεραπείας. Μερικά επικυρωμένα μοριακά τεστ για τον καρκίνο του μαστού είναι: Oncotype DX, MammaPrint και uPA/PAI-1. Οι περισσότερες μορφές BrCa αντιμετωπίζονται αρχικά με χειρουργική επέμβαση και ανάλογα με την περίπτωση ακολουθεί χημειοθεραπεία, ορμονοθεραπεία, ακτινοθεραπεία ή συνδυασμός αυτών. Παρά την αποτελεσματικότητα των υφιστάμενων θεραπειών για τον BrCa, επισημαίνεται ότι αυτές συνοδεύονται από ποικίλα μειονεκτήματα που επηρεάζουν την ποιότητα ζωής των ασθενών. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνονται η απώλεια μαλλιών, η κόπωση καθώς και οι ψυχολογικές επιπτώσεις που οφείλονται εν μέρει στην μαστεκτομή και τη δια βίου παρακολούθηση των ασθενών. Ακόμη και σήμερα, οι τρέχοντες κλινικοί δείκτες αδυνατούν στην έγκαιρη διάγνωση και εξατομικευμένη πρόγνωση της νόσου. Επομένως, υπάρχει ανάγκη για την ταυτοποίηση νέων μοριακών βιοδεικτών σύμφωνα με τις επιταγές της ιατρικής ακρίβειας.
Τα μη κωδικά μόρια RNA αποτελούν μετάγραφα RNA που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες και χωρίζονται σε δύο κατηγορίες ως προς το μέγεθός τους: μεγάλα μη κωδικά RNA (lncRNAs, >200 nt) και τα μικρά μη κωδικά RNA (sncRNAs, <200 nt). Πληθώρα μελετών έχουν αναδείξει τον καθοριστικό ρόλο των sncRNAs στη ρύθμιση των σηματοδοτικών μονοπατιών που ευνοούν την εξέλιξη του BrCa. Τα microRNAs (miRNAs), ανήκουν στην ομάδα των sncRNA, και ρυθμίζουν αρνητικά την γονιδιακή έκφραση, μέσω της δέσμευσής τους στις 3’-αμετάφραστες περιοχές (3’-UTR) των μεταγράφων τους. Τα ογκογονίδια ERBB2 και EGFR υπερεκφράζονται στον BrCa και φαίνεται ότι μπορεί να γίνουν στόχος από διάφορα miRNAs. Η μελέτη των miRNAs, που στοχεύουν ογκογονίδια στον BrCa, έχει κεντρίσει τα τελευταία χρόνια το παγκόσμιο ερευνητικό ενδιαφέρον, θέτοντας ως στόχο την ανακάλυψη νέων μοριακών βιοδεικτών και θεραπευτικών στόχων για την ακριβή πρόβλεψη της πορείας της νόσου και την αποτελεσματικότερη εξατομικευμένη θεραπεία.
Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη έκφρασης και η κλινική αξιολόγηση ενός πάνελ miRNAs (miR-26b, miR-143 και miR-205), τα οποία στοχεύουν τα ογκογονίδια ERBB2 και EGFR στον καρκίνο του μαστού. Για τους σκοπούς της εργασίας, χρησιμοποιήθηκαν 82 δείγματα ιστού, εκ των οποίων 41 δείγματα από όγκους μαστού και 41 δείγματα φυσιολογικού παρακείμενου ιστού. Αρχικά, έγινε απομόνωση του ολικού RNA από τα ιστοτεμάχια και ακολούθησε 3’-πολυαδενυλίωση και αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA. Στη συνέχεια, έγινε in silico ανάλυση χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων miRDB, miRwalk και Diana-Micro αναζητώντας τα miRNAs που στοχεύουν τα ογκογονίδια ERBB2 και EGFR στον BrCa. Από τις βάσεις αυτές, επιλέχθηκαν τα miRNAs που εμφανίζονταν κοινά και στις τρεις βάσεις. Ακολούθησε εκτενής βιβλιογραφική αναζήτηση για την επιλογή των επικυρωμένων miRNAs που στοχεύουν τα συγκεκριμένα ογκογονίδια. Στη συνέχεια, αξιοποιήθηκαν οι ομάδες ασθενών TCGA-BrCa και Metabric και το δημόσια διαθέσιμο εργαλείο KMplotter (https://kmplot.com/analysis/) και πραγματοποιήθηκε κλινική αξιολόγηση και ανάλυση επιβίωσης. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης ανέδειξαν την επιλογή των τελικών τριών miRNAs (miR-26b, miR-143 και miR-205) για την μελέτη τους στην ομάδα ελέγχου. Κατόπιν, έγινε ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μεθοδολογίας για την ποσοτικοποίηση των miR-26b, miR-143 και miR-205, μέσω ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (Real Time qPCR), χρησιμοποιώντας το φθορισμογόνο ανιχνευτή SYBR Green I. Τέλος, για την κλινική αξιολόγηση των miRNAs ενδιαφέροντος ως βιοδείκτες διάγνωσης και πρόγνωσης στον καρκίνο του μαστού, έγινε μια εκτενής βιοστατιστική ανάλυση με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών.
Από τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης, φαίνεται ότι τα miRNAs ενδιαφέροντος μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες διαφοροδιάγνωσης, για την ανίχνευση καρκίνου μαστού. Και στις τρεις περιπτώσεις, τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs παρουσίασαν μια στατιστικά σημαντική μείωση στο καρκινικό σε σύγκριση με το φυσιολογικό μέρος ιστού του μαστού. Η ανάλυση καμπύλων ευαισθησίας-ειδικότητας, κατέδειξε το miRNA-26b ως βέλτιστο δείκτη, καθώς παρουσιάζει το μεγαλύτερο εμβαδόν κάτω από την καμπύλη (AUC=0.858), υποδηλώνοντας ανώτερη διαγνωστική αξία. Επίσης, λήφθηκαν αρκετά ενδιαφέροντα αποτελέσματα από τη μελέτη της πιθανής σχέσης ανάμεσα στην έκφραση των miRNAs ενδιαφέροντος και διαφόρων κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών. Και τα τρία miRNAs είχαν στατιστικά σημαντικά μειωμένα επίπεδα έκφρασης σε PR+ όγκους σε σχέση με τους όγκους που δεν εκφράζουν υποδοχέα προγεστερόνης. Το miRNA-26b φάνηκε να εμφανίζει μια στατιστικά σημαντική μείωση στα επίπεδα έκφρασης του σε όγκους που είχαν εξαπλωθεί σε γειτονικούς λεμφαδένες (Ν+) σε σύγκριση με τους όγκους που δεν είχαν εξαπλωθεί σε λεμφαδένες (Ν0). Όσον αφορά το miR-143, τα επίπεδα έκφρασης του συγκεκριμένου μορίου φάνηκε να σχετίζονται με τον ιστολογικό βαθμό κακοήθειας, όπου παρατηρήθηκε μια στατιστικά σημαντική αύξηση τους σε όγκους υψηλού βαθμού κακοήθειας (Grade III) σε σχέση με όγκους χαμηλότερου βαθμού κακοήθειας (Grades I και ΙΙ). Το miRNA-205 ήταν το μόριο με τις περισσότερες συσχετίσεις επιπέδων έκφρασης και κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών. Η έκφραση του miRNA-205 φάνηκε να είναι αυξημένη σε όγκους TNBC σε σύγκριση με τους όγκους των υπολοίπων μοριακών υποτύπων (Luminal A, Luminal B, HER2). Επίσης, παρατηρήθηκε μια στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων του miR-205 σε όγκους υψηλού βαθμού κακοήθειας (Grade III), σε σχέση με τους όγκους Grade I και ΙΙ. Επιπρόσθετα, μειωμένα επίπεδα έκφρασης του miR-205 παρατηρήθηκαν στου ER+ σε σχέση με τους όγκους που δεν εκφράζουν υποδοχείς οιστρογόνων. Τέλος, αυξημένα επίπεδα του miR-205, ανιχνεύτηκαν σε όγκους μαστού που είναι θετικοί ως προς την έκφραση του πυρηνικού αντιγόνου Ki-67, σε σύγκριση με τους όγκους που είχαν χαμηλή έκφραση του Ki-67.
Συμπερασματικά, τα miR-26b, miR-143 και miR-205 φαίνεται να είναι πολύ υποσχόμενα μόρια για την διάγνωση καρκίνου μαστού. Επίσης, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την διάκριση των κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών των ασθενών και έτσι να συμβάλλουν στη σωστή επιλογή εξατομικευμένης θεραπείας. Παρ’ όλα αυτά είναι αναγκαία η περαιτέρω μελέτη τους όσον αφορά στην συμβολή τους στην πρόβλεψη της της εξέλιξης της νόσου και της επιβίωσης των ασθενών.
(EL)
Breast cancer (BrCa) is the most frequent type of cancer among women worldwide. Despite being such a prevalent and serious malignancy, advances in modern clinical and pharmaceutical oncology render it curable in the vast majority of cases, if it is detected early. Breast cancer can be classified into sporadic, familial, or hereditary and the onset of disease is usually associated with a combination of genetic and environmental factors. BrCa is a systemic disease that primarily affects the breast lobes and milk ducts, although it can extend throughout the body. Each subtype is highly heterogeneous at the molecular and cellular levels, with distinct pathological characteristics and clinical outcomes, which influence treatment planning and selection. The use of screening, especially mammography, as part of a personalized approach for women over 40 has led to earlier diagnosis and improved patient management. Biopsy remains the «gold standard» diagnostic procedure, providing significant information about tumor type and guiding treatment options.
Breast cancer progression is mainly linked to two factors: the expression of various receptors (such as estrogen receptors, progesterone receptors, and epidermal growth factor receptors) and the rate of cell growth. The three main BrCa subtypes are a) hormone receptor-positive (ER+ or PR+), b) ERBB2 oncogene overexpression (HER2+), and c) triple-negative breast cancer (TNBC) (ER-, PR-, HER2-). Although the exact mechanisms are still being studies, breast cancer development appears to be influenced by sex steroid hormones, mutations in specific oncogenes like HER2 or EGFR, and the inactivation of tumor suppressor genes like BRCA1 and BRCA2.The identification of cancer biomarkers in biological specimens can provide significant insights into diagnosis, prognosis, and treatment monitoring. Some validated molecular tests for breast cancer include Oncotype DX, MammaPrint, and uPA/PAI-1. Most forms of breast cancer are initially treated with surgical procedures, followed by chemotherapy, hormone therapy, radiotherapy, or a combination thereof. Despite the effectiveness of existing treatments for BrCa, it is noted that they are accompanied by various drawbacks that affect the quality of life of patients. Among these are hair loss, fatigue, and psychological impacts partly due to mastectomy and lifelong patient monitoring. Even today, current clinical diagnostic tools and some prognostic indicators have limitations in early detection and personalizing treatment plans for breast cancer. Therefore, there is a critical need to identify new molecular biomarkers that align with the principles of precision medicine.
Non-coding RNA molecules are RNA transcripts that do not encode proteins. They are divided into several categories, including long non-coding RNA (lncRNA), small non-coding RNA (sncRNA). Research has shown that sncRNAs play a crucial role in regulating signaling pathways that promote BrCa progression. MicroRNAs (miRNAs), a subset of sncRNAs, can suppress the expression of oncogenes and tumor suppressor genes by binding to their 3’-untraslated regions. The oncogenes ERBB2 and EGFR are overexpressed in BrCa and appear to be targeted by various miRNAs. In recent years, global research interest has risen in the study of miRNAs targeting oncogenes in BrCa, with the objective of discovering new molecular biomarkers and therapeutic targets for more precise disease prognosis and personalized treatment.
The aim of this thesis is to study the expression and clinical evaluation of a specific microRNA panel (miR-26b, miR-143, and miR-205), targeting the known oncogenes ERBB2 and EGFR in breast cancer. For the purposes of this study, 41 breast tumor samples and 41 samples of normal adjacent tissue were used. Initially, total RNA was isolated from the tissue specimens, followed by 3'-polyadenylation and reverse transcription of the total RNA. Then, an in silico analysis was conducted using the miRDB, miRwalk, and Diana-Micro databases to identify the miRNAs targeting the ERBB2 and EGFR oncogenes in BrCa. From these databases, miRNAs that appeared commonly in all three databases were selected. This was followed by an extensive literature search to select validated miRNAs targeting these specific oncogenes. Subsequently, the TCGA-BrCa and Metabric patient cohorts and publicly available KMplotter tool (https://kmplot.com/analysis/) were utilized for clinical evaluation and survival analysis. The results of the analysis highlighted the selection of the final three miRNAs (miR-26b, miR-143, and miR-205) for further study in the control group. Next, a methodology was developed and optimized for the quantification of miR-26b, miR-143, and miR-205 using quantitative Real-Time PCR (Real-Time qPCR), using the fluorescent dye SYBR Green I. Finally, for the clinical evaluation of the miRNAs of interest as diagnostic and prognostic biomarkers in breast cancer, a comprehensive biostatistical analysis was conducted using the clinical-pathological characteristics of the patients and their survival outcomes.
The results of the statistical analysis suggest that these miRNAs can be used as biomarkers for the diagnosis of breast cancer. The expression levels of these miRNAs were significantly lower in cancerous breast tissue compared to normal breast tissue. Sensitivity and specificity curve analysis revealed miRNA-26b to be the best biomarker, with the largest area under the curve (AUC=0.858), indicating superior diagnostic value. Additionally, interesting results were obtained from the study of the potential relationship between the expression of the miRNAs of interest and various clinicopathological characteristics. All three miRNAs had significantly lower expression levels in PR+ tumors compared to tumors that did not express progesterone receptors. miRNA-26b appears to have significantly lower expression levels in tumors that had spread to lymph nodes (N+) compared to tumors that had not spread to lymph nodes (N0). For miR-143, the expression levels of this molecule appeared to be related to histological grade, with a significant increase observed in Grade III compared to Graded I and II. The molecule with the most correlations between expression levels and clinicopathological characteristics was miRNA-205. The expression of miRNA-205 appeared to be increased in TNBC tumors compared to tumors of the other molecular subtypes (Luminal A, Luminal B, HER2). Additionally, a significant increase in miR-205 levels was observed in Grade III tumors compared to Grade I and Grade II tumors. Furthermore, decreased expression levels of miR-205 were observed in ER+ tumors compared to tumors that did not express estrogen receptors. Also, increased levels of miR-205 were detected in breast tumors that are positive for the expression of the nuclear antigen Ki-67, compared to tumors that had low Ki-67 expression.
In conclusion, miR-26b, miR-143 and miR-205 appear to be promising molecules for the diagnosis of breast cancer. They could also be used to distinguish the clinicopathological characteristics of patients and thus contribute to the correct selection of personalized therapy. However, further study is needed to determine their role in overall patient survival.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
