Εισαγωγή: Τα φάρμακα με βάση τον λευκόχρυσο ή σύμπλοκα λευκόχρυσου, γνωστά και ως πλατίνες, ανήκουν στην κατηγορία χημειοθεραπευτικών φαρμάκων. Χρησιμοποιούνται ευρέως στη θεραπεία πολλών τύπων καρκίνου και επιδεικνύουν υψηλή αποτελεσματικότητα. Ωστόσο, η μη στοχευμένη δράση τους σέ όλα τα ταχέως διαιρούμενα κύτταρα, οδηγεί σε υψηλή τοξικότητα και παρενέργειες. Με σκοπό την βελτίωση της χημειοθεραπείας με τη χρήση συμπλόκων λευκόχρυσου, μια νέα προσέγγιση έχει αναδειχθεί, η στοχευμένη θεραπεία. Η στοχευμένη θεραπεία περιλαμβάνει την ανάπτυξη νέων συμπλόκων λευκόχρυσου που έχουν σχεδιαστεί για να στοχεύουν εκλεκτικά σε στόχους, χαρακτηριστικούς των καρκινικών κυττάρων, επιτυγχάνοντας υψηλότερη αποτελεσματικότητα και χαμηλότερη τοξικότητα. Στόχος: Στόχος της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη εργαλείων που δύναται να χρησιμοποιηθούν στη μελέτη της έκφρασης ενός πιθανού στόχου για στοχευμένη θεραπεία, του Μεταφορέα Εξαρτώμενου από το Νάτριο ή SMVT και στην επιβεβαίωση την χαμηλής τοξικότητας και υψηλής αποτελεσματικότητας των νέων συμπλόκων λευκόχρυσου που τον στοχεύουν. Μέθοδοι: Όσον αφορά την μελέτη της έκφρασης του SMVT, γνωστός και ως υποδοχέας της βιοτίνης, πραγματοποιήθηκαν πειράματα επαγωγής πολλαπλασιασμού ύστερα από την χορήγηση βιοτίνης (η οποία σύμφωνα με τη βιβλιογραφία προκαλεί πολλαπλασιασμό) με σκοπό την συσχέτιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα. Τα επίπεδα του υποδοχέα προσδιορίστηκαν επίσης μέσω της ανάπτυξης βιοαναλυτικής μεθόδου LC-MS/MS, η οποία βασίστηκε στην ανίχνευση πεπτιδίου χαρακτηριστικού για τον SMVT σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Για την επιβεβαίωση της χαμηλής τοξικότητας και ταυτόχρονης υψηλής αποτελεσματικότητας των νέων αναλόγων, αναπτύχθηκαν in vivo πρωτόκολλα αξιολόγησης τοξικότητας και αποτελεσματικότητας. Πιο συγκεκριμένα, αναπτύχθηκε αρχικά ένα πιλοτικό πρωτόκολλο αιματοτοξικότητας της μορφής 2 δόσεων καρβοπλατίνης των 60 mg/kg, για το έλεγχο της ικανότητας της καρβοπλατίνης να προκαλεί τοξικότητα. Στην συνέχεια ακολούθησε ένα μεγαλύτερης διάρκειας πρωτόκολλο των 2 δόσεων καρβοπλατίνης των 60 mg/kg, για τρεις εβδομάδες, με σκοπό την προσομοίωση των κύκλων χημειοθεραπείας που υφίσταται ένας ασθενής. Τέλος, με σκοπό την βελτιστοποίηση του πρωτοκόλλου, ώστε αυτό να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση της τοξικότητας νέων αναλόγων, αναπτύχθηκε το πρωτόκολλό μειωμένης δόσης και διάρκειας και αυξημένου όγκου ένεσης, της δόσης καρβοπλατίνης των 36 mg/kg για δύο εβδομάδες σε όγκο ένεσης 400 μL. Το πρωτόκολλο αυτό στοχεύει να προβλέπει περιορισμούς όπως μειωμένη διαλυτότητα των νέων αναλόγων σε σχέση με τη καρβοπλατίνη και να είναι σύντομο και ήπιο προς το πειραματόζωο. Με σκοπό την μελλοντική αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας, αναπτύχθηκε πρωτόκολλο ξενομοσχεύματος με τη χρήση κυττάρων MCF7. Αποτελέσματα: Η χορήγηση βιοτίνης σε εύρος συγκεντρώσεων 1 nM-2500 nM δεν προκάλεσε υπέρ-πολλαπλασιασμό σε σχέση με την ομάδα control. Τα επίπεδα του SMVT, προσδιορίστηκαν αυξημένα στις καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa, PC3, A549, MCF7, HepG2 και SKBR3, συγκριτικά με την φυσιολογική κυτταρική σειρά NIH-3T3, μέσω της ανάλυσης κυτταρικών δειγμάτων με την μέθοδο LC-MS/MS. Όσον αφορά τα πρωτόκολλα αξιολόγησης τοξικότητας, η δόση καρβοπλατίνης των 60 mg/kg προκάλεσε τοξικότητα με επίδραση στα αιμοπετάλια στο πέρας 4 ημερών και επίδραση σε όλα τα στοιχεία του αίματος στο πέρας των τριών εβδομάδων. Το πρωτόκολλο των 36 mg/kg προκάλεσε ήπιας μορφής τοξικότητα σε όλα τα στοιχεία του αίματος στο πέρας των δύο εβδομάδων. Τέλος η ανάπτυξη ξενομοσχεύματος πραγματοποιήθηκε με την χρήση κυττάρων MCF7 και προκάλεσε τον σχηματισμό όγκων στους μύες. Συμπέρασμα: Τα υψηλά επίπεδα του SMVT σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές, που μελετήθηκαν με τη χρήση νέας βιοαναλυτικής μεθόδου LC-MS/MS, συγκριτικά με τα φυσιολογικά κύτταρα, υποδεικνύουν υπερέκφραση του SMVT, επιβεβαιώνοντας την δυνατότητα χρήση του ως πιθανό στόχο για στοχευμένη θεραπεία. Ταυτόχρονα τα in vitro πειράματα δραστικότητας των νέων αναλόγων υποδεικνύουν πως τα υψηλά επίπεδα του SMVT στις κυτταρικές σειρές, συνάδουν με την υψηλή αποτελεσματικότητα τους σε αυτές. Τέλος τα πρωτόκολλα τοξικότητας που αναπτύχθηκαν δύναται να χρησιμοποιηθούν για την αποτελεσματική προκλινική αξιολόγηση των νέων αναλόγων και την περεταίρω ανάπτυξη τους.
(EL)
Introduction: Platinum-based drugs, also known as platins, are a kind of platinum complexes, that are a prominent class of chemotherapy drugs employed in the treatment of various cancers, known for their substantial efficacy. However, their non-targeted action on all rapidly dividing cells results in significant toxicity and undesirable side effects. To enhance platinum-based chemotherapy, a novel approach known as targeted therapy has emerged. Targeted therapy involves the development of novel platinum-based analogs engineered to specifically target distinct characteristics unique to cancer cells, thereby achieving heightened efficacy with minimal toxicity. Objective: The aim of this thesis is to create tools for investigating the expression of a potential target for targeted therapy, the Sodium Dependent Multivitamin Transporter (SMVT), and to substantiate the low toxicity and remarkable efficacy of novel platinum-based analogs designed to target it. Methods: The expression of SMVT, also known as the biotin receptor, was examined through proliferation induction experiments conducted subsequent to the administration of biotin, which is recognized in the literature for its ability to induce proliferation. This was done to establish a correlation between cell proliferation and SMVT expression levels. Additionally, SMVT levels were determined through the development of an LC-MS/MS bioanalytical method based on the detection of a peptide characteristic of SMVT in various cell lines. To confirm the low toxicity and high efficacy of the new analogs, in vivo toxicity and efficacy evaluation protocols were established. Initially, a pilot hematotoxicity protocol involving two doses of 60 mg/kg of carboplatin was designed to assess the potential toxicity of carboplatin. Subsequently, a longer-term protocol consisting of two doses of carboplatin at 60 mg/kg for three weeks was implemented to simulate the chemotherapy cycles experienced by patients. Furthermore, to optimize the protocol for assessing the toxicity of new analogs, a modified protocol with reduced dosage and duration, and increased injection volume, involving a 36 mg/kg dose of carboplatin administered over two weeks with an injection volume of 400 µL was developed. This modification aimed to address issues such as reduced solubility of the new analogs relative to carboplatin, and to provide a shorter and gentler experience for experimental animals. To evaluate the efficacy in the future, a xenograft protocol was developed using MCF7 cells. Results: The administration of biotin in concentrations ranging from 1 nM to 2500 nM did not induce proliferation compared to the control group. Analysis of cell samples by LC-MS/MS revealed elevated SMVT levels in HeLa, PC3, A549, MCF7, HepG2, and SKBR3 cancer cell lines in comparison to the normal NIH-3T3 cell line. In terms of toxicity evaluation protocols, the 60 mg/kg carboplatin dose produced toxicity with an impact on platelets after 4 days and an effect on all blood values after three weeks. The 36 mg/kg protocol resulted in mild toxicity in all blood components after two weeks. Finally, xenograft development using MCF7 cells led to the formation of tumors in mice. Conclusion: The heightened levels of SMVT in all the cancer cell lines studied, as compared to normal cells, affirm the overexpression of SMVT, thus supporting its potential as a target for targeted therapy. Simultaneously, the in vitro cytotoxicity experiments with the new analogs indicate that the increased SMVT levels in the cell lines correspond to the enhanced effectiveness of the new platinum-based analogs within them. Lastly, the developed toxicity protocols can be effectively utilized for the preclinical evaluation of new analogs and their subsequent advancement.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
