Η χορήγηση Τ κυττάρων που φέρουν χιμαιρικούς υποδοχείς αντιγόνου (CARs) αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση ανοσοθεραπείας του καρκίνου. Αν και το 90 % των κακοηθειών αφορά τους συμπαγείς όγκους, η εφαρμογή των CAR Τ κυττάρων περιορίζεται, μέχρι στιγμής, στις αιματολογικές κακοήθειες. Αυτό οφείλεται στο μικροπεριβάλλον των συμπαγών όγκων και συγκεκριμένα στην ανοσοκαταστολή που αυτό επιφέρει. Ως εκ τούτου, απαιτούνται νέες προσεγγίσεις για την ενίσχυση της δραστικότητας και της επιβίωσης των CAR Τ κυττάρων εντός των όγκων. Μια τέτοια προσέγγιση αποτελεί η αποσιώπηση του υποδοχέα immunoglobulin-like transcript 2 (ILT2) σε CAR Τ κύτταρα. Ο εν λόγω υποδοχέας είναι ανασταλτικός, διαθέτει ευρεία έκφραση στο μικροπεριβάλλον των όγκων και προσδέτες του αποτελούν τα ανθρώπινα λευκοκυτταρικά αντιγόνα (HLA) τάξης Ι, κυρίως το HLA-G. Μάλιστα, στα Τ κύτταρα έχει ήδη φανεί η αποτελεσματικότητα των αντι-ILT2 αντισωμάτων στην in vitro διέγερση των αποκρίσεών τους και κλινικές δοκιμές βρίσκονται σε εξέλιξη. Στα πλαίσια αυτά, η παρούσα διπλωματική εργασία αποσκοπούσε στην αναστολή της έκφρασης του υποδοχέα ILT2 σε κύτταρα με χιμαιρικούς υποδοχείς CD16 (CR-CD16) μέσω της τεχνολογίας CRISPR-Cas9. Η αποσιώπηση επιχειρήθηκε, αρχικά, με τη χρήση πλασμιδιακών φορέων, αλλά δεν παρατηρήθηκε κάποια γονιδιακή τροποποίηση του υποδοχέα ILT2. Αντ’ αυτού, λοιπόν, χρησιμοποιήθηκαν ριβονουκλεοπρωτεϊνικά (RNP) σύμπλοκα και επιτεύχθηκαν υψηλά ποσοστά αποσιώπησης. Κατά τη βελτιστοποίηση του πρωτοκόλλου ηλεκτροδιάτρησης ταυτοποιήθηκε η σημασία συγκεκριμένων παραμέτρων της πειραματικής διαδικασίας και το αποτέλεσμα που μπορεί να επιφέρει η τροποποίησή τους. Ακολούθως, η κατασκευή ολοκληρώθηκε με την επιμόλυνση αποσιωπημένων κυττάρων με lenti ιικό φορέα που θα επέφερε την έκφραση του CR-CD16. Τέλος, για τη μελλοντική δοκιμή της κυτταροτοξικής δραστικότητας των CR-CD16 Τ κυττάρων με αποσιώπηση του ILT2 ετοιμάστηκαν και HLA-G Raji κύτταρα-στόχοι.
(EL)
The administration of T cells bearing chimeric antigen receptors (CARs) represents a promising cancer immunotherapy approach. However, although 90 % of malignancies involve solid tumors, the application of CAR T cells has so far been limited to hematological malignancies. This limitation is attributed to the tumor microenvironment and specifically the immunosuppression it induces. As a result, new approaches are needed to enhance the activity and survival of CAR T cells infiltrating the tumor. One such approach is the knockout of the immunoglobulin-like transcript 2 (ILT2) receptor in CAR T cells. This inhibitory receptor is widely expressed in the tumor microenvironment, and its ligands include human leukocyte antigens (HLA) class I, mainly HLA-G. In fact, the effectiveness of anti-ILT2 antibodies in stimulating T cell responses in vitro has already been demonstrated, and clinical trials are underway. Within this context, the present thesis aimed to inhibit the expression of the ILT2 receptor in cells with chimeric CD16 receptors (CR-CD16) using the CRISPR-Cas9 technology. Knockout was initially attempted using plasmid vectors, but no genetic modification of the ILT2 receptor was observed. Therefore, ribonucleoprotein (RNP) complexes were used instead, achieving high knockout rates. During the optimization of the electroporation protocol, the importance of specific parameters and the effects of their modification were highlighted. Subsequently, the construct was completed by transducing knocked out cells with a lentiviral vector that would induce the expression of CR-CD16. Finally, for the future testing of the cytotoxic activity of CR-CD16 T cells with ILT2 knockout, HLA-G Raji target cells were prepared.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
