Τα τελευταία χρόνια έχει παρατηρηθεί πολύ μεγάλη πρόοδος στη διαγνωστική
ογκολογία με την εφαρμογή εξειδικευμένων ραδιοεπισημασμένων ενώσεων
(ραδιοφαρμάκων) μοριακής στόχευσης. Κυρίως η έρευνα επικεντρώνεται στην
ανάπτυξη ραδιοεπισημασμένων πεπτιδίων τα οποία παρουσιάζουν πολλά πλεονεκτήματα
για εφαρμογή στη κλινική ογκολογία, όπως ταχεία βιοκινητική, μεγάλη ικανότητα
διείσδυσης στον καρκινικό ιστό λόγω μικρού μοριακού βάρους και χαμηλή
αντιγονικότητα. Τα ραδιοπεπτίδια αλληλεπιδρούν επιλεκτικά με βιομόρια-στόχους,
δηλαδή πρωτεϊνικούς υποδοχείς, οι οποίοι υπερεκφράζονται στην επιφάνεια των
καρκινικών κυττάρων. Επομένως λειτουργούν ως μεταφορείς διαγνωστικών ή
θεραπευτικών ραδιονουκλιδίων στους ιστούς στόχους (καρκινικές εστίες),
παρέχοντας δυνατότητα απεικόνισης τους ή και καταστροφής τους.
Η μπομπεσίνη (BBΝ) είναι ένα δεκατετραπεπτίδιο με μεγάλη συγγένεια για τους
υποδοχείς του γαστρινοεκλυτικού πεπτιδίου (GRP-Rs) οι οποίοι υπερεκφράζονται σε
πολλούς συνήθεις ανθρώπινους όγκους, όπως σε καρκίνο του προστάτη και του
μαστού.
Στη παρούσα διατριβή περιγράφεται η σύνθεση και η προκλινική αξιολόγηση νέων
ανταγωνιστών μπομπεσίνης επισημασμένων με 99mTc για εφαρμογή στη στοχευμένη
απεικονιστική διάγνωση GRP-R θετικών όγκων.
Ως οδηγός-ένωση χρησιμοποιήθηκε ο ανταγωνιστής μπομπεσίνης
[D-Phe6,Leu-NHEt13]BBΝ(6-13), στην οποία έγιναν επεμβάσεις στο N-τελικό άκρο,
στο C-τελικό άκρο και/ή στη πεπτιδική αλυσίδα.
Ως ραδιονουκλίδιο επιλέχθηκε το 99mTc λόγω των ιδανικών του πυρηνικών
ιδιότητων. Για τη σταθερή συναρμογή του 99mTc χρησιμοποιήθηκε τετραμίνη
ανοικτής αλυσίδας τύπου H2NCH2CH2NH(CH2)3NHCH2CH2NH2 (2,3,2-tet). Η επισήμανση
ήταν σχεδόν ποσοτική και τα επισημασμένα πεπτίδια παραλήφθηκαν σε υψηλή
καθαρότητα όπως επιβεβαιώθηκε με ραδιοχημικό έλεγχο.
Η συγγένεια των νέων αναλόγων για τον GRP-R μελετήθηκε με πειράματα
ανταγωνιστικής δέσμευσης έναντι [125Ι-Τyr4]BBN σε μεμβράνες κυττάρων PC-3 και
βρέθηκε ιδιαίτερα υψηλή, υψηλότερη ακόμα και από την ένωση αναφοράς [Tyr4]BBΝ
καταδεικνύοντας την ευνοϊκή επίδραση του τετραμινικού υποκαταστάτη στο N-τελικό
άκρο των πεπτιδίων αυτών. Η ικανότητα δέσμευσης μετά τη συναρμογή του
ραδιομετάλλου μελετήθηκε αντιπροσωπευτικά για το [99gTc/99mTc]Demobesin 8 με
πειράματα δέσμευσης κορεσμού υποδοχέων σε κύτταρα PC-3. Η συγγένεια δέσμευσης
για τον GRP-R ήταν ιδιαίτερα υψηλή, με τιμή Kd = 0.24±0.03 nM, καταδεικνύοντας
ότι η παρουσία του (ραδιο)μεταλλικού συμπλόκου στο Ν-τελικό άκρο της πεπτιδικής
αλυσίδας ευνοεί τη δέσμευση στον GRP-R.
Πειράματα δέσμευσης των ραδιοπεπτιδίων της παρούσας διατριβής σε κύτταρα PC-3
έδειξαν ποσοστά δέσμευσης ανάλογα της συγγένειας του κάθε αναλόγου και την
απουσία εσωτερίκευσης, η οποία είναι συμβατή με συμπεριφορά ανταγωνιστή. Η
ανταγωνιστική δράση επιβεβαιώθηκε επιλεκτικά για τα Demobesin 8 και Demobesin
10 σε κύτταρα HEK-GRPR.
Η μεταβολική σταθερότητα του [99mTc]Demobesin 8 μελετήθηκε σε πλάσμα αίματος,
ομογενοποίημα νεφρών ποντικού και ούρα ποντικιού. Το [99mTc]Demobesin 8
αποικοδομείται αργά στο πλάσμα ενώ στα νεφρά αποικοδομείται ταχέως σε
υδρόφιλους μεταβολίτες. Ανάλυση με HPLC ούρων που συλλέχθηκαν 30 min μετά την
ενδοφλέβια χορήγηση του ραδιοπεπτιδίου έδειξε πλήρη αποικοδόμησή του.
Τα αποτελέσματα των μελετών βιοκατανομής κατά την ενδοφλέβια χορήγηση των
επισημασμένων αναλόγων σε υγιή και παθολογικά πρότυπα πειραματοζώων συμφωνούν
με τα αποτελέσματα των μελετών in vitro. Διαπιστώθηκε ταχεία απομάκρυνση από το
αίμα και το υπόστρωμα με κύρια οδό απέκκρισης το ουροποιητικό σύστημα.
Η κύρια οδός απέκκρισης του [99mTc]Demobesin 8 είναι διαμέσου των νεφρών προς
τα ούρα και όχι μέσω του ηπατοχολικού συστήματος λόγω υψηλής υδροφιλικότητας.
Αυτό αναμένεται να οδηγήσει σε ταχύτερη κάθαρση και σε μείωση της ραδιενέργειας
υποστρώματος άρα και σε πιθανή ευκρινέστερη απεικόνιση GRP-R θετικών όγκων. Η
υψηλότερη ειδική πρόσληψη στα όργανα που εκφράζουν φυσιολογικά τον GRP-R όπως
είναι το πάγκρεας παρατηρήθηκε για το [99mTc]Demobesin 8. Η διαδικασία για όλα
τα ραδιοπεπτίδια διαμεσολαβείται από τους GRP-Rs, όπως αποδείχθηκε κατόπιν in
vivo αποκλεισμού των θέσεων δέσμευσης με συγχορήγηση περίσσειας [Tyr4]BBΝ με το
εκάστοτε ραδιοπεπτίδιο. Σε ποντίκια τύπου SCID στα οποία έχουν μεταμοσχευθεί
ανθρώπινα ετερομοσχεύματα PC-3 το [99mTc]Demobesin 8 πέτυχε και πάλι τις
υψηλότερες τιμές πρόσληψης στον όγκο.
Σε σύγκριση με άλλα πεπτίδια ανταγωνιστές μπομπεσίνης της βιβλιογραφίας το
[99mTc]Demobesin 8 έδειξε υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης για τον GRP-R και
υψηλότερες τιμές πρόσληψης στον πειραματικό όγκο. Επιπλέον σύγκριση με τα
ραδιοπεπτίδια - αγωνιστές όπως [99mTc]Demobesin 3-6 επιβεβαιώνει την
αποτελεσματικότερη στόχευση GRP-R - θετικών καρκινωμάτων από ραδιοπεπτίδια-
ανταγωνιστές.
Η παρούσα διατριβή οδήγησε με επιτυχία στην ανάπτυξη νέων
99mTc-ραδιοεπισημασμένων ανταγωνιστών μπομπεσίνης για εφαρμογή στη στοχευμένη
απεικονιστική διάγνωση GRP-R θετικών όγκων στον άνθρωπο. Η προκλινική αυτή
αξιολόγηση κατέδειξε ως ραδιοπεπτίδιο επιλογής το [99mTc]Demobesin 8 δεδομένου
ότι συνδυάζει σημαντικά κριτήρια για κλινική εφαρμογή, όπως σταθερότητα, ταχεία
και υψηλή in vivo στόχευση των GRP-Rs και ταχεία κάθαρση από παρακείμενους
ιστούς και επομένως σε υψηλής ευκρίνειας απεικονίσεις.
(EL)
In recent years important progress has been made in diagnostic oncology by
applying specialized site-specific radiolabeled compounds. Research is mainly
focusing on the development of radiolabeled peptides because they offer several
advantages such as rapid biokinetics, high penetration capacity into cancer
tissue due to their low molecular weight and low antigenicity. Radiopeptides
interact selectively with target-biomolecules (peptide receptors) which are
overexpressed on the surface of cancer cells. Therefore, they act as
transporters of diagnostic or therapeutic radionuclides to the target
(malignant lesions), providing the possibility of high contrast imaging or cell
damage.
Bombesin is a 14-amino acid peptide with high affinity for gastrin releasing
peptide receptors (GRP-Rs) which are overxpressed in a variety of human tumors
including prostate and breast cancers.
In the present thesis, the synthesis and preclinical evaluation of novel
bombesin antagonists radiolabeled with 99mTc for potential application in
targeted diagnostic imaging of GRP-R+ tumors, is described.
Synthesis of the new peptides was based on the bombesin antagonist peptide
[D-Phe6,Leu-NHEt13]BBN(6-13) and modifications occurred at the N-terminus,
C-terminus and/or at the peptide chain of this antagonist.
The radionuclide of choice was 99mTc because of its ideal nuclear properties. A
bifunctional tetraamine precursor H2NCH2CH2NH(CH2)3NHCH2CH2NH2 (2,3,2-tet) was
used for the stable binding of 99mTc. Incorporation of 99mTc by the tetraamine
unit was almost quantitative as it was confirmed by chromatographic analysis.
Binding affinity of the new analogs for the GRP-R was studied with competition
binding experiments in PC-3 cell membranes and it was high, even higher than
the peptide of reference [Tyr4]BBN. These results show the favorable effect of
the tetraamine complex at the N-terminus of the new peptides. Also the binding
affinity of the radiolabeled peptide was studied for [99gTc/99mTc]Demobesin 8
by saturation binding experiments in whole PC-3 cells and it was significantly
high (Kd = 0.24±0.03 nM) indicating that the presence of the [TcV(O)2N4)]+
complex at the N-terminus of the peptide affects positively the binding
affinity to GRP-R.
Metabolic studies for [99mTc]Demobesin 8 were conducted in mouse plasma, kidney
homogenates and urine. [99mTc]Demobesin 8 survived long enough in mouse
plasma, whereas in kidney homogenates it rapidly degraded in hydrophilic
metabolites and it is finally excreted into urine. HPLC analysis in urine that
were collected 30 min after the intravenous injection of the radiopeptide
showed full degradation in the kidneys.
Biodistribution studies in healthy and pathological animal models after
intravenous injection of the radiolabeled peptides confirmed the in vitro
results. The radioactivity rapidly cleared from the blood and background
tissues and it was excreted mainly via kidneys and the urinary system.
As it was mentioned before the main route of excretion of [99mTc]Demobesin 8 is
via the kidneys and the urinary system and not through the hepatobiliary system
due to high hydrophilicity. This is expected to lead in rapid excretion from
background tissues and hence a possible better imaging of GRP-R positive
tumors. Also higher uptake in organs that expressing GRP-R such as pancreas was
observed for [99mTc]Demobesin 8. The process was GRP-R mediated, as shown by
in vivo receptor blockade by co-injection of excess of [Tyr4]BBN with each
radiopeptide. In SCID mice bearing human PC-3 xenografts expressing the human
GRP-R, [99mTc]Demobesin 8 achieved the higher uptake in tumor.
In comparison with other radiolabeled bombesin antagonists, which are known in
the literature, [99mTc]Demobesin 8 showed the highest binding affinity for
GRP-R and also in vivo the highest tumor uptake. Moreover compared with agonist
radiopeptides such as [99mTc]Demobesin 3-6 showed the more effective targeting
of GRP-R by antagonist peptides.
In conclusion, this thesis successfully led in the development of new
99mTc-radiolabeled bombesin antagonists for diagnostic imaging of GRP-R
positive tumors in human. This preclinical evaluation showed as the
radiopeptide of choice [99mTc]Demobesin 8 because satisfied important criteria
and combined a variety of favorable properties for successful application in
the targeted diagnostic imaging of GRP-R positive tumors such as favorable
pharmacokinetics, metabolic stability as well as rapid and high in vivo GRP-R
targeting which can led to satisfactory tumor images
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
