Η πλασματική μεμβράνη εμπλέκεται σε διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες, ο
συντονισμός των οποίων απαιτεί τη δυναμική οργάνωση των συστατικών της, σε
μεμβρανικές περιοχές διαφορετικής λιπιδικής και πρωτεϊνικής σύστασης. Τα στικτά
πρωτεϊνικά συμπλέγματα που ονομάζονται εισοσώματα, τουλάχιστον εν μέρει,
συμβάλλουν στη διαμερισματοποίηση της πλασματικής μεμβράνης των μυκήτων. Στο
νηματοειδή μύκητα Aspergillus (Emericella) nidulans, οι εισοσωμικές πρωτεΐνες
PilA και PilB, ομόλογες των Pil1/Lsp1 του Saccharomyces cerevisiae, και η SurG,
ομόλογη της Sur7, συναρμολογούνται και σχηματίζουν πυκνές στικτές κοκκιώδεις
δομές στα προϊόντα του αφυλετικού κύκλου ζωής του μύκητα, τα κονιδιοσπόρια
Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μελετήθηκε η κατανομή και η έκφραση των
εισοσωμικών πρωτεϊνών κατά τη διάρκεια του φυλετικού κύκλο ζωής του A.nidulans.
Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι κύριες εισοσωμικές πρωτεΐνες, PilA, PilB και
SurG δεν εκφράζονται στα κύτταρα hulle ή τα πρώιμα ασκοσπόρια αλλά αντίθετα
εκφράζονται στα ώριμα ασκοσπόρια. Σε αδρανή ώριμα ασκοσπόρια, η πρωτεΐνη PilΑ
σχηματίζει στατικές στικτές δομές στην πλασματική μεμβράνη των ασκοσπορίων.
Παρόμοια, η PilB εντοπίζεται στην περιφέρεια των ασκοσπορίων αλλά
συγκεντρώνεται κυρίως στις περιοχές όπου τα δύο μισά ενός ασκοσπορίου
ενώνονται. Τέλος, η SurG εντοπίζεται τόσο στη μεμβράνη των ασκοσπορίων όσο και
περιπυρηνικά - ενδοπλασματικό δίκτυο. Σε εκβλαστημένα ασκοσπόρια, οι στικτές
δομές κατά μήκος της υφής αποτελούνται αποκλειστικά από την πρωτεΐνη PilΑ. Η
PilB εντοπίζεται διάχυτη στο κυτταρόπλασμα και η SurG στοχεύετε στα χυμοτόπια,
τα ενδοσώματα αλλά εντοπίζεται και σε στικτούς κοκκιώδεις σχηματισμούς στην
κεφαλή των υφών. Η κατανομή αυτών των πρωτεϊνών είναι πανομοιότυπη με αυτή που
βρέθηκε σε νεαρές υφές προερχόμενες από κονιδιοσπόρια. Επιπλέον, σε
εκβλαστημένα ασκοσπόρια οι PilΑ στικτοί σχηματισμοί δεν συνεντοπίζονται με τις
ιδιαίτερα κινητικές στικτές δομές της ΑbpΑ, ενός μάρτυρα ενδοκύττωσης κυστιδίων
καλυμμένων με πλέγμα κλαθρίνης. Παρουσία μυριοσίνης – ειδικού αναστολέα της
βιοσύνθεσης σφιγγολιπιδίων – τα PilΑ κοκκία των νεαρών υφών που προέρχονται από
ασκοσπόρια, είναι λιγότερα σε αριθμό και η τοπολογία τους έχει σημαντικά
αλλοιωθεί, υποδηλώνοντας συσχέτιση μεταξύ της εισοσωμικής PilΑ και της
βιοσύνθεσης των σφιγγολιπιδίων.
Επιπρόσθετα, καθώς η πρωτεΐνη Nce102 του S. cerevisiae έχει προταθεί ότι
αποτελεί μέρος ενός αισθητήρα των επίπεδων των σφιγγολιπιδίων, διερευνήθηκε ο
ρόλος της AnNce102 στον A. nidulans. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η AnNce102
σχηματίζει σταθερές δομές με χαμηλή κινητικότητα που συνεντοπίζονται με τα
εισοσώματα και διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην πυκνότητα/αριθμό των
PilA/SurG κοκκίων στην κεφαλή νεαρών υφών. Επιπλέον, δείχθηκε ότι οι πρωτεΐνες
AnNce102 και PilA ρυθμίζουν αρνητικά τη βιοσύνθεση σφιγγολιπιδίων, καθώς
απαλοιφές των γονιδίων τους καταστέλλουν μερικώς τη θερμοευαισθησία του
στελέχους basA1, το οποίο κωδικοποιεί για την C4-υδροξυλάση, υπεύθυνη για τη
μετατροπή της διϋδροσφιγγοσίνης σε φυτοσφιγγοσίνη. Επιπλέον, απαλοιφές των
γονιδίων annce102 και pilA καταστέλλουν μερικώς τη μη φυσιολογική ανάπτυξη που
παρατηρείται μετά από επώαση των κυττάρων με τους αναστολείς της βιοσύνθεσης
των σφιγγολιπιδίων, μυριοσίνη και αουρεοβασιδίνη Α. Ταυτόχρονα, δείχθηκε ότι
απενεργοποίηση της κινάσης YpkA μιμείται τη γενετική ή τη φαρμακολογική μείωση
των σφιγγολιπιδίων, γεγονός, το οποίο υποδεικνύει την άμεση σχέση της κινάσης
με τη ρύθμιση του μονοπατιού της βιοσύνθεσης των σφιγγολιπιδίων. Στις ίδιες
συνθήκες παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση δραστικών μορφών οξυγόνου (ΔΜΟ- ROS), η
οποία μπορούσε εν μέρει να ξεπεραστεί με την απαλοιφή των γονιδίων pilA και
annce102. Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, παρατηρήθηκε ευαισθησία ή
ανθεκτικότητα των annce102Δ ή/και pilAΔ στελεχών σε διαφορετικούς οξειδωτικούς
παράγοντες, ενώ η υπερέκφραση της AnNce102 αποκαθιστά τον αριθμό και την
οργάνωση των PilA/SurG κοκκίων σε κύτταρα με διαταραγμένα επίπεδα
σφιγγολιπιδίων και επιπρόσθετα οδηγεί στον «άτυπο» εντοπισμό των PilA κοκκίων
στα διαφράγματα.
(EL)
The plasma membrane is implicated in a variety of functions, whose coordination
necessitates highly dynamic organization of its constituents into domains of
distinct protein and lipid composition. Eisosomes, at least partially, mediate
this lateral plasma membrane compartmentalization. In the model filamentous
fungus Aspergillus nidulans, PilA and PilB, two homologues of the Saccharomyces
cerevisiae eisosome proteins Pil1/Lsp1, and SurG, a strict orthologue of Sur7,
are assembled and form tightly packed structures in conidiospores, products of
the asexual cycle.
Our results show that core eisosome proteins PilA, PilB and SurG are not
expressed in hulle cells or early ascospores, but are expressed in mature
ascospores. In mature but quiescent ascospores, PilA forms static punctate
structures (foci) at the plasma membrane. PilB also was observed at the
ascospore membrane as well, with higher concentration at the areas where the
two halves of ascospores are joined together. Finally, SurG was localized both
at the membrane of ascospores and perinuclearly. In germlings originating from
ascospores the punctate structures along the hypha were shown to be composed
only of PilA. PilB is diffused in the cytoplasm and SurG was located in
vacuoles, endosomes and in foci in the hyphal head. This localization is
identical to that found in germlings originated from conidiospores. In
germinated ascospores PilA foci did not colocalise with the highly mobile and
transient peripheral punctate structures of AbpA, a marker for sites of
clathrin-mediated endocytosis. Deletions of each one or all the three core
eisosomal genes do not affect viability or germination of ascospores. In the
presence of myriocin – a specific inhibitor of sphingolipid biosynthesis –
PilA-GFP foci of ascospore germlings were less numerous and their distribution
was significantly altered, suggesting a correlation between PilA foci and
sphingolipid biosynthesis.
Moreover due to the fact that the tetraspan protein Nce102 has been implicated
as part of a sensor for sphingolipid homeostasis, the role of Nce102 homologue
(AnNce102) in A.nidulans was investigated. We showed that AnNce102 forms stable
structures with low mobility that colocalizes with eisosomes and plays a
crucial role in density/number of PilA/SurG foci in the head of germlings. In
addition we demonstrate that AnNce102 and PilA negatively regulate sphingolipid
biosynthesis, since their deletions partially suppress the thermosensitivity of
basA mutant encoding sphingolipid C4-hydroxylase and the growth defects
observed upon treatment with inhibitors of sphingolipid biosynthesis, myriocin
and Aureobasidin A. Moreover, we show that YpkA repression mimics genetic or
pharmacological depletion of sphingolipids, conditions that induce the
production of Reactive Oxygen Species (ROS) and can be partially overcome by
deletion of pilA and/or annce102. Consistent with these findings, pilAΔ and
annce102Δ also show differential sensitivity to various oxidative agents, while
AnNce102 overexpression can bypass sphingolipid depletion regarding the
PilA/SurG foci number and organization, also leading to the mis-localization of
PilA to septa.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
