Η καλμοδουλίνη (CaM) αποτελεί σημαντικό ρυθμιστή (αναστολέα) του καρδιακού
υποδοχέα ρυανοδίνης τύπου-2 (RyR2) που δρα ως δίαυλος απελευθέρωσης Ca2+ από το
ΣΔ, διαδραματίζοντας κύριο ρόλο στον μηχανισμό της σύζευξης διέγερσης-συστολής.
Παρόλο που ο μηχανισμός αλληλεπίδρασης CaM/RyR2 δεν είναι πλήρως γνωστός, είναι
κοινώς αποδεκτό ότι η κύρια περιοχή πρόσδεσης της CaM στον RyR2 αντιστοιχεί
στην αμινοξική αλληλουχία 3583-3603, ενώ σειρά δεδομένων υποδεικνύει τη
συμμετοχή και άλλων περιοχών του RyR2 στην πρόσδεση της CaM. Από την άλλη
πλευρά, μεταλλαγμένες μορφές της CaM, με πιθανόν πλημμελή ικανότητα ρύθμισης
του RyR2, εντοπίστηκαν πρόσφατα σε ασθενείς με καρδιακή δυσλειτουργία. Σκοπός
της παρούσας διατριβής ήταν αφενός η μελέτη του μηχανισμού αλληλεπίδρασης της
αγρίου τύπου CaM (CaMWT) με τον RyR2 και αφετέρου η μελέτη της αλληλεπίδρασης
μεταλλαγμένων μορφών της CaM με τον RyR2. Για τη μελέτη της αλληλεπίδρασης
CaMWT/RyR2 έγινε σύνθεση οκτώ πεπτιδικών τμημάτων του RyR2 καθώς και παραγώγων
τους. Τα πεπτίδια αξιοποιήθηκαν κυρίως στη μελέτη πιθανής αλληλεπίδρασης με την
CaMWT, με πειράματα συγκατακρήμνισης, τύπου ELISA και θερμιδομετρίας ισόθερμης
τιτλοδότησης. Ορισμένα RyR2-πεπτίδια αξιοποιήθηκαν επίσης ως αντιγόνα για την
ανάπτυξη πολυκλωνικών αντισωμάτων, ενώ αναπτύχθηκαν και αντι-πεπτιδικά
αντισώματα ικανά να αναγνωρίζουν την CaMWT, που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα
τύπου ELISA. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, τo C-τελικό άκρο του RyR2 είναι
πιθανόν να περιέχει μία επιπλέον περιοχή πρόσδεσης της CaMWT(4255-4277). Για τη
μελέτη της αλληλεπίδρασης μεταλλαγμένων μορφών της CaM με τον RyR2 έγινε
παραγωγή έξι μεταλλαγμένων μορφών της CaM καθώς και παρασκευή βαρέων κυστιδίων-
φορέων ΣΔ από καρδιές χοίρων (ως πηγής RyR2). Στη συνέχεια, μελετήθηκε, σε
σχέση με την CaMWT, τόσο η επίδραση των μεταλλαγμένων μορφών της CaM στη
λειτουργικότητα του RyR2, με πειράματα πρόσδεσης [3Η]ρυανοδίνης στον RyR2, όσο
και η ικανότητα πρόσδεσής τους στον RyR2, με πειράματα συγκατακρήμνισης. Όπως
προέκυψε, συγκεκριμένες μεταλλάξεις της CaM (N54I, F90L, D96V, D130G)
επηρεάζουν την ικανότητα πρόσδεσης στον RyR2 και, ταυτόχρονα, τη
λειτουργικότητα του υποδοχέα. Περαιτέρω αξιοποίηση των μοριακών εργαλείων και
των τεχνικών, που αναπτύχθηκαν στην παρούσα διατριβή, θα βοηθήσει στην καλύτερη
κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την καρδιακή λειτουργία.
(EL)
Calmodulin (CaM) is an important regulator (inhibitor) of the cardiac ryanodine
receptor type-2 (RyR2) function as a calcium release channel of SR, playing a
pivotal role in excitation-contraction coupling. Although the mechanism of
CaM/RyR2 interaction is not fully understood, it is widely accepted that the
main CaM binding domain is located within residues 3583–3603 of RyR2, while a
series of data suggest that additional regions in RyR2 can act as potential CaM
binding domains. On the other hand, anumber of CaM mutants, with possibly
impaired RyR2-regulatory capacity, have been recently characterized in patients
with heart dysfunction. The goal of the present thesis was to study the
mechanism of the interaction between wild type CaM (CaMWT) and RyR2 as well as
to study the interaction between certain CaM mutants and RyR2. In order to
study the CaMWT/RyR2 interaction, eight peptide fragments of RyR2 and
derivatives thereof were synthesized. Potential binding of the above synthetic
peptides to CaMWT was studied by means of pull-down, ELISA-type and isothermal
titration calorimetry experiments. Moreover, some of the RyR2-peptides were
used as antigens for the development of polyclonal antibodies, while
anti-peptide polyclonal antibodies for full-length CaMWT were also developed
and used in the ELISA-type experiments. According to the results obtained, the
C-terminus of RyR2 seems to contain an additional CaMWT binding domain
(4255-4277). For studying the interaction between CaM mutants and RyR2, six CaM
mutants were produced and heavy SR vehicles from pig hearts (as a source of
RyR2) were prepared. Consequently, the effect of the CaM mutants on the RyR2
activity was tested, in comparison with CaMWT, with the [3H]ryanodine binding
assay, while binding of the CaM mutants to RyR2 was also evaluated, in
comparison with CaMWT too, with pull-down experiments. As revealed by the
results obtained, specific CaM mutations (N54I, F90L, D96V, D130G) affect both,
binding capacity to RyR2 and the channel activity. Further exploitation of the
molecular tools and the techniques developed in the framework of this thesis
will help us better understand and elucidate the mechanisms underlying cardiac
function.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
