Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η πιο συχνή κακοήθης πάθηση του πεπτικού
συστήματος σε ΗΠΑ και Ευρώπη. Στη χώρα μας, ο καρκίνος του παχέος εντέρου
καταλαμβάνει την τέταρτη θέση των αιτιών θανάτου από νεοπλάσματα. Οι κυριότεροι
καρκινικοί δείκτες παχέος εντέρου που χρησιμοποιούνται στη σύγχρονη κλινική
πράξη είναι το καρκινοεμβρυικό αντιγόνο CEA (carcinoembryonic antigen), το
υδατανθρακικό αντιγόνο CA 19-9 (carbohydrate antigen 19-9), το καρκινικό
αντιγόνο CA 72-4 (cancer antigen 72-4) και ο ενεργοποιητής του πλασμινογόνου
των ιστών PLAT (tissue plasminogen activator).‘Έχουν αναγνωριστεί αρκετοί
προγνωστικοί δείκτες και δείκτες πρόβλεψης για τον καρκίνο του παχέος εντέρου,
αν και πολύ λίγοι από αυτούς χρησιμοποιούνται σήμερα στην κλινική πράξη.
Η οικογένεια γονιδίων των ανθρώπινων ιστικών καλλικρεϊνών είναι η μεγαλύτερη
συνεχόμενη γονιδιακά οικογένεια πρωτεασών στο ανθρώπινο γονιδίωμα, χωρίς
παρέμβαση από άλλα γονίδια. Aποτελεί σημαντικό τομέα μελέτης, καθώς ένα από τα
μέλη της, το PSA/KLK3, είναι ο πλέον αποδεκτός και ευρέως χρησιμοποιημένος
καρκινικός δείκτης, μέχρι σήμερα. Συγκεκριμένα για τον καρκίνο του παχέος
εντέρου, μελέτες έχουν υποδείξει άλλα μέλη της οικογένειας ως πιθανούς δείκτες
πρόγνωσης ή/και πρόβλεψης, συμπεριλαμβανομένων των KLK4 και KLK7, σε επίπεδο
mRNA, καθώς και KLK5, KLK7 και KLK11,σε επίπεδο πρωτενης.
Το γονίδιο της KLK10 είναι ένα νέο μέλος της οικογένειας των ιστικών
καλλικρεϊνών. Αρκετές μελέτες έχουν διεξαχθεί προκειμένου να αξιολογηθεί ο
πιθανός ρόλος της KLK10 ως καρκινικός δείκτης. Λόγω των υψηλότερων επιπέδων της
στους καρκινικούς ιστούς και στον ορό ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών, η KLK10
έχει προταθεί ως διαγνωστικός και προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο των
ωοθηκών, σε συνδυασμό με τον ήδη χρησιμοποιούμενο δείκτη CA125, για αύξηση της
διαγνωστικής ευαισθησίας.
Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, έγινε μελέτη της έκφρασης και κλινική
αξιολόγηση του γονιδίου KLK10 για πιθανή εφαρμογή του ως νέο προγνωστικό δείκτη
για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Αναπτύχθηκαν αναλυτικά πρωτόκολλα για τον
προσδιορισμό της έκφρασης mRNA του γονιδίου KLK10 στον καρκίνο του παχέος
εντέρου, βασιζόμενα στην αντίστροφη μεταγραφή (RT), στην αλυσιδωτή αντίδραση
πολυμεράσης (PCR) και στη μεθοδολογία ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο
(real-time PCR). Η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεΐνης KLK10,
πραγματοποιήθηκε με ανοσοδοκιμασία ELISA. Δεν υπάρχουν και δεν χρησιμοποιήθηκαν
έτοιμα kit για τους παραπάνω προσδιορισμούς αλλά πραγματοποιήθηκε έλεγχος
ποιότητας των τεχνικών που αναπτύχθηκαν ώστε να εξασφαλιστεί η αξιοπιστία των
προσδιορισμών. Συλλέχθηκε ένα στατιστικά σημαντικό μέγεθος καρκινικών και μη
καρκινικών ιστών παχέος εντέρου (194 ιστολογικά δείγματα) από ασθενείς με
πλήρες κλινικό ιστορικό. Για την ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε
εκτενής βιοστατιστική ανάλυση. Χρησιμοποιήθηκαν παραμετρικές και μη
παραμετρικές μεθοδολογίες, ανάλυση ROC, ανάλυση Kaplan Meier, καθώς και ανάλυση
μονομεταβλητής και πολυμεταβλητής Cox παλινδρόμησης.
Τα αποτελέσματα που προέκυψαν δείχνουν ότι η έκφραση mRNA του γονιδίου KLK10
σχετίζεται σε στατιστικά σημαντικό βαθμό με διάφορες κλινικοπαθολογικές
παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένων της σταδιοποίησης κατά Dukes (P=0,036), του
βαθμού αποδιαφοροποίησης (P=0,025), της μετάστασης στους λεμφαδένες (P=0,046)
και της μετάστασης σε απομακρυσμένα όργανα (P=0,027). Η ανάλυση επιβίωσης κατά
Kaplan Meier έδειξε στατιστικώς σημαντικά μικρότερες πιθανότητες ελεύθερης
νόσου (DFS) και ολικής επιβίωσης (OS) των ασθενών με θετική έκφραση mRNA του
γονιδίου της KLK10 (P=0,014 και P=0,020, αντίστοιχα). Η έκφραση της πρωτεΐνης
KLK10 ήταν σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (P<0,001) υψηλότερη στα καρκινικά
δείγματα απ’ότι στα φυσιολογικά. Συμπερασματικά, στους καρκινικούς ιστούς
παχέος εντέρου που εξετάστηκαν παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του γονιδίου της
KLK10. Η υπερέκφραση αυτή φαίνεται να σχετίζεται με δυσμενή πρόγνωση σε
ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και μπορεί να συνιστά ένα χρήσιμο νέο
μοριακό δείκτη.
Στη συνέχεια, έγιναν πειράματα σε καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου ώστε να
διαπιστωθεί ενάν το γονίδιο KLK10 εμπλέκεται στην ανταπόκριση των ασθενών σε
κυτταροστατικά φάρμακα, γεγονός που θα εξηγούσε αρκετά από τα παραπάνω
συμπεράσματα. Πιο συγκεκριμένα, έγινε καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων της
κυτταρικής σειράς ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος HT-29, για την οποία
κατασκευάστηκαν καμπύλες βιωσιμότητας. Στη συνέχεια, έγινε επίδραση με
χημειοθεραπευτικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη συστηματική θεραπεία του
καρκίνου του παχέος εντέρου(φθοροουρακίλη, οξαλιπλατίνη), καθώς και με άλλα,
ευρέως διαδεδομένα αντικαρκινικά φάρμακα (σισπλατίνη, δοσεταξέλη, γεμσιταβίνη).
Για πρώτη φορά, μετά το τέλος της επίδρασης με το χημειοθεραπευτικό παράγοντα,
ακολούθησε καλλιέργεια των εναπομείνοντων κυττάρων σε πλήρες θρεπτικό υλικό,
προκειμένου να αξιολογήσουμε εάν τα κύτταρα συνεχίζουν να αποπίπτουν ή εάν
επανέρχονται σε κανονική κυτταρική διαίρεση, όταν απομακρύνεται πλέον το
φάρμακο. Κατόπιν, μελετήθηκαν οι μεταβολές στο προφίλ έκφρασης mRNA του
γονιδίου KLK10 καθώς και άλλων γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση: BCL2,
BCLX, MCL1, BAX, BAK1, BIM, BID, PUMA (BBC3), NΟΧΑ (PMAIP1), BIRC5 (Survivin),
και P21 (CDKN1A).
Στο γονίδιο KLK10 παρατηρήθηκαν οι σημαντικότερες μεταβολές στα επίπεδα
έκφρασης του mRNA με την επεξεργασία του με φθοροουρακίλη και σισπλατίνη, ενώ
μικρότερης έκτασης ήταν οι μεταβολές κατά την επεξεργασία του με τα υπόλοιπα
φάρμακα. Τέλος, ενδιαφέρον παρουσίασε και το γεγονός ότι το πρότυπο έκφρασης
mRNA του γονιδίου KLK10 συνολικά ακολουθούσε το πρότυπο έκφρασης του προ-
αποπτωτικού γονιδίου NOXA.
Όσον αφορά τα μέλη της οικογένειας BCL2, ανάλογα με το χημειοθεραπευτικό
παράγοντα που χρησιμοποιήθηκε, παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις στο
πρότυπο έκφρασής τους. Η μεταγραφική ενεργοποίηση κάποιων μελών σε κάθε
επίδραση με κυτταροτοξικό παράγοντα όμως, υποδεικνύει πως, ανάλογα με το
ερέθισμα, τα προαποπτωτικά μέλη ξεκινούν το μονοπάτι της απόπτωσης. Η θέση του
κάθε μορίου μπορεί να είναι στρατηγικής σημασίας, προκειμένου να εξασφαλιστεί
το μονοπάτι της απόπτωσης. Αυτό θα μπορούσε να αποδώσει έναν ενοποιημένo ρόλο
στα αντιαποπτωτικά μέλη της οικογένειας που διαθέτουν μόνο BH3 περιοχή. Και
ίσως ένας τέτοιος μηχανισμός να αποδεικνύεται από τη μεταγραφική ενεργοποίηση
διαφορετικών μελών της οικογένειας κατά την επίδραση με διαφορετικούς
χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Αξίζει να αναφερθεί, τέλος, πως τα επίπεδα
έκφρασης mRNA του αντιαποπτωτικού γονιδίου BCL2 μειώθηκαν σε κάθε επίδραση με
κυτταροτοξικό παράγοντα, το οποίο έρχεται σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες
όπου υπερέκφραση του γονιδίου συνδυαζόταν με ανοχή στη χημειοθεραπεία.
Ένα δεύτερο σημαντικό σημείο που προκύπτει από την παρούσα μελέτη είναι η χρήση
των χημειοθεραπευτικών δοσεταξέλη και σισπλατίνη για την καταπολέμηση του
καρκίνου του παχεός εντέρου. Απο την εφαρμογή και των δύο παραγόντων, τα
κύτταρα συνέχισαν να αποπίπτουν και μετά την αφαίρεσή τους από τη φλάσκα
καλλιέργειας.
Εν κατακλείδι, η έκφραση του γονιδίου KLK10, τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε
επίπεδο πρωτενης, αποτελεί δυσμενή προγνωστικό δείκτη στον καρκίνο του παχέος
εντέρου, καθώς σχετίζεται με μικρότερη πιθανότητα ελευθέρας νόσου και ολικής
επιβίωσης, το οποίο και αποτελεί το σημαντικότερο αποτέλεσμα της παρούσας
διατριβής. Η μεταγραφική του ενεργοποίηση μετά από επίδραση χημειοθεραπευτικών
παραγόντων, του προσδίδει και ένα πιθανό ρόλο ως δείκτη απόκρισης σε
χημειοθεραπεία. Η κατανόηση των μηχανισμών ρύθμισης και η ανακάλυψη των
φυσιολογικών υποστρωμάτων του ενζύμου αυτού, θα βοηθήσουν και σε μετέπειτα
αξιολόγησή του ως πιθανό στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου.
(EL)
Colon cancer is the most frequent malignant disease of the digestive system in
USA and Europe. In our country, colon cancer ranked fourth among causes of
death from neoplasms. The biomarkers used in modern clinical practice are the
Carcinoembryonic Antigen (CEA), the Carbohydrate Antigen 19-9 (CA 19-9), the
72-4 Cancer Antigen (CA 72-4) and the Tissue plasminogen activator (PLAT).
Although several prognostic and predictive markers for colon cancer have been
recognized, very few of them are currently used in clinical practice.
The human tissue kallikrein gene family is the largest contiguous gene family
of proteases in the human genome, with no intervention from other genes. It is
a very attractive field of study, as one of its members, the famous PSA/KLK3,
is the most accepted and widely used cancer biomarker, until today. Studies
have suggested other family members as potential biomarkers for prognosis
or/and prediction of colon cancer, including KLK4 and KLK7, at mRNA level, and
KLK4, KLK7 and KLK11, at protein level.
KLK10 gene is a new member of the kallikrein tissue family. Several studies
have been conducted to assess the potential role of KLK10 as a tumor marker.
Due to its higher levels in tumor tissues and serum of patients with ovarian
cancer, KLK10 has been proposed as diagnostic and prognostic marker for ovarian
cancer, in combination with the already used marker CA125, for increased
diagnostic sensitivity.
In this thesis, we performed clinical evaluation of the KLK10 gene for its
possible application as a new prognostic marker for colorectal cancer. The mRNA
expression study was performed with conventional RT-PCR and quantitative PCR
methodology in real-time (real-time PCR), and the protein was detected and
measured by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Analytical protocols
were developed to determine the mRNA expression of KLK10 gene in colorectal
cancer based on reverse transcription (RT), polymerase chain reaction (PCR) and
quantitative real-time PCR (real-time PCR) methodology. Detection and
quantification of protein KLK10 performed by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(ELISA). There weren’t any ready kit to be used for the abovementioned
experiments, all the assays were developed in our lab, so we also performed
quality control in order to ensure the reliability of the results. We collected
a statistically significant size from cancerous and non- cancerous colon tissue
samples (194 tissues), from patients with complete clinical history. For the
analysis of data, an extensive biostatistical analysis was performed. We used
parametric and nonparametric methodologies, ROC analysis, Kaplan-Meier survival
analysis, as well as univariate and multivariate Cox regression analysis.
The results obtained showed that the mRNA expression of the KLK10 gene is
statistically associated with several clinicopathological parameters, including
Duke’s Stage (P=0.036), Grade (P=0.025), lymph nodes status (P=0.046) and
distant organs metastasis (P=0.027). The Kaplan Meier survival analysis showed
statistically significantly shorter possibility of disease-free (DFS) and
overall survival (OS) of patients with positive KLK10 mRNA expression (P=0.014
and P=0.020, respectively). The expression of KLK10 protein was statistically
significant higher in tumor samples than in normal counterparts (P<0.001). In
conclusion, the cancerous colon tissues examined showed a higher expression of
KLK10 gene. The over-expression of this appears to be associated with poor
prognosis in patients with colon cancer and may constitute a useful novel
molecular biomarker.
We then cultured colorectal adenocarcinoma cell line HT-29, for which we
constructed viability curves, followed by treatment with chemotherapy drugs
used in systematic treatment of colon cancer (fluorouracil, oxaliplatin), as
well as with other widely used cancer drugs (taxotere, cisplatin, gemcitabine).
For the first time, after the treament with the administered agent, we removed
the agent and we continued the cell culture, in order to evaluate whether the
cells continue to die or if they revert to normal cell division, when the drug
is removed. Then, we evaluated the mRNA expression profiles of KLK10 gene, as
well as other genes involved in apoptosis: BCL2, BCLX, MCL1, BAX, BAK1, BIM,
BID, PUMA (BBC3), NΟΧΑ (PMAIP1), BIRC5 (Survivin), and P21 (CDKN1A).
KLK10 mRNA expression levels were elevated, after the treatment with
fluorouracil and cisplatin, while smaller scale changes were observed with the
treatment with other drugs. Finally, what was very interesting, was the fact
that KLK10 mRNA pattern of expression followed the mRNA pattern of expression
of the proapoptotic NOXA gene.
Regarding the BCL2 family members, depending on the chemotherapeutic agent
used, other members expression levels increased, while others decreased and
others remained the same. The transcriptional activation of some members in
each treatment with cytotoxic agent, however, suggests that, depending on the
stimulus, the proapoptotic members begin their path to apoptosis. The position
of each molecule may be of strategic importance in order to ensure the pathway
of apoptosis. This could reveal a unified role in proapoptotic BH3-only family
members. Perhaps such a mechanism is established by the transcriptional
activation of different members of the family, during the treatment with
different chemotherapeutic agents. It is worth noting, finally, that the mRNA
expression of the antiapoptotic BCL2 gene was downregulated in the presence of
all the abovementioned cytotoxic agents, which is in agreement with previous
studies where overexpression of the gene was combined with tolerance to
chemotherapy. A second important point that emerges from this study, is the use
of taxotere and cisplatin in colon cancer chemotherapy. From treatment with
both agents, the cells continued to die, even after their removal from the
flask.
Finally, the expression of the KLK10 gene, at both mRNA and protein level, has
features of an unfavorable prognostic marker for colon cancer, as it is
associated with shorter disease free and overall survival, and this is the most
important result of this thesis. Its transcriptional activation after treatment
with chemotherapeutic agents, perhaps assigns it a possible role as a biomarker
for response to chemotherapy. The understanding of regulation mechanisms and
the discovery of the physiological substrate of this enzyme, will lead to its
evaluation as a potential target for colon cancer treatment.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
