Η μελέτη των επιπτώσεων της ατμοσφαιρικής ρύπανσης στην υγεία συνιστά ένα
πολυδιάστατο και πολυπαραγοντικό πρόβλημα, που εξακολουθεί να αποτελεί
αντικείμενο ενός τεράστιου αριθμού τοξικολογικών και επιδημιολογικών ερευνών.
Σήμερα, η πλειοψηφία αυτών των μελετών επικεντρώνεται κυρίως στο σωματιδιακό
κλάσμα της ρύπανσης (particulate matter, PM), δηλαδή στα αιωρούμενα στερεά
σωματίδια με αεροδυναμική διάμετρο 10μm, τα οποία θεωρούνται τα πλέον
επικίνδυνα. Λόγω των διαστάσεών τους, τα σωματίδια αυτά διεισδύουν και
συσσωρεύονται στα βαθύτερα σημεία του αναπνευστικού συστήματος, ενώ ο υψηλός
λόγος «επιφάνεια/μάζα», επιτρέπει την προσρόφηση ποικίλων τοξικών ενώσεων στην
επιφάνειά τους. Μεταξύ αυτών, τα βαρέα μέταλλα, οι πολυκυκλικές οργανικές
ενώσεις, ανόργανα ιόντα και ποικίλα βιογενή συστατικά ενοχοποιούνται – κατά
κανόνα – για την τοξική δράση των ρύπων. Σε επίπεδο οργανισμού, οι επιπτώσεις
της ατμοσφαιρικής ρύπανσης, καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα παθοφυσιο-λογικών
καταστάσεων, από απλούς δερματικούς ερεθισμούς και αλλεργικές αντιδράσεις, έως
χρόνια αναπνευστικά προβλήματα, θανάτους από καρδιαγγειακά αίτια και αυξημένο
κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου. Εκτός, όμως, από τις φυσικοχημικές ιδιότητες των
σωματιδιακών ρύπων, καθοριστικό ρόλο σε αυτές τις επιπτώσεις διαδραματίζουν και
επιπλέον παράγοντες, που αφορούν κυρίως στις συνθήκες έκθεσης (διάρκεια και
συχνότητα επεισοδίων έκθεσης, συγκέντρωση ρύπων) και στην ατομική ευαισθησία
(ηλικία, παθολογικό υπόβαθρο).
Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η καταγραφή των πρώιμων
σηματοδοτικών αποκρίσεων ενός μοντέλου επιθηλιακών κυττάρων πνεύμονα (Α549),
παρουσία μικρο- και νανο-σωματιδιακών ρύπων, διαφορετικής προέλευσης και
πολυπλοκότητας, προκειμένου να εντοπιστούν πρώιμες αλλαγές στη φυσιολογία και
τη σηματοδότηση των κυττάρων, που ενδέχεται να συμβάλλουν μακροπρόθεσμα στην
ανάπτυξη παθολογικού φαινοτύπου. Η ιστοειδικότητα των παρατηρούμενων αποκρίσεων
διερευνήθηκε μέσω συγκριτικής καταγραφής της απόκρισης ανθρώπινων επιθηλιακών
κυττάρων δέρματος (Α431), ενώ παράλληλα, μελετήθηκε και ο ρόλος των αντίστοιχων
φυσιολογικών ινοβλαστών. Μεταξύ των σηματοδοτικών μορίων και των μεταγραφικών
παραγόντων, που μελετήθηκαν, ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στην κινάση Αkt και στον
μεταγραφικό παράγοντα ΗΙF-1α, οι οποίοι προωθούν την κυτταρική επιβίωση και
θεωρούνται, πλέον, τυπικοί καρκινικοί δείκτες, καθώς ανιχνεύονται σε υψηλά
επίπεδα κατά τα πρώτα στάδια της καρκινογένεσης. Επιπλέον, ο μεταγραφικός
παράγοντας NrF2 χρησιμοποιήθηκε ως ένας αξιόπιστος δείκτης οξειδωτικού στρες.
Οι κατηγορίες ρύπων, που μελετήθηκαν, ήταν οι εξής: α) ένα πολύπλοκο
μικροσωματιδιακό μίγμα (ΡΜ2,5-10), που συλλέχθηκε στους χώρους εργοστασίου, σε
βιομηχανική περιοχή της Αθήνας, β) ένα πρότυπο μίγμα νανοσωματιδίων από
εξατμίσεις μηχανών εσωτερικής καύσης (Diesel Exhaust Particles, DEP) και γ) ο
κοινός οργανικός ρύπος, βενζο[α]πυρένιο (Β[α]Ρ). Το Β[α]Ρ, αν και δεν έχει
σωματιδιακή φύση, επιλέχθηκε ως ένα από τα βασικά οργανικά συστατικά των δύο
προηγούμενων μιγμάτων, προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός δράσης
των οργανικών ρύπων.
Παρουσία των μικροσωματιδιακών ρύπων παρατηρήθηκε σημαντική μείωση της
κυτταρικής επιβίωσης, η οποία ήταν αντιστρόφως ανάλογη της διαμέτρου των
σωματιδίων. Η κυτταροτοξική δράση του ανόργανου κλάσματος ήταν εντονότερη, σε
σύγκριση με το οργανικό, και θα μπορούσε, εν μέρει, να αποδοθεί στις υψηλές
συγκεντρώσεις θειικών και αμμωνιακών ιόντων, που ανιχνεύθηκαν κατά τη χημική
ανάλυση. Σε κάθε περίπτωση, παρατηρήθηκε, παράλληλη δοσοεξαρτώμενη μείωση στην
φωσφορυλίωση της κινάσης Αkt και στα πρωτεϊνικά επίπεδα του μεταγραφικού
παράγοντα HIF-1α.
Τα νανοσωματίδια DEP επιλέχθηκαν ως βασικό συστατικό του οργανικού κλάσματος
της σωματιδιακής ρύπανσης. Χαμηλές, μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις των DEP
προκάλεσαν ήπιο οξειδωτικό στρες (επαγωγή NrF2), χωρίς να μειώνουν την
κυτταρική επιβίωση και οδήγησαν σε άμεση συσσώρευση του ΗΙF-1α. Επιπλέον, τα
επίπεδα του μεταγραφικού παράγοντα αυξήθηκαν αθροιστικά, ύστερα από δύο δίωρες
επωάσεις με τα νανοσωματίδια και δεν επανήλθαν, ακόμα και μετά την απομάκρυνση
των ρύπων, για 22 ώρες. Η παράλληλη επαγωγή της οξυγενάσης της αίμης, ΗΟ-1, σε
αυτές τις συνθήκες, υποδηλώνει την προηγηθείσα ενεργοποίηση του μεταγραφικού
παράγοντα NrF2. Οι αποκρίσεις των κυττάρων Α549 ήταν αντίστοιχες, στο σύστημα
συγκαλλιέργειας των επιθηλιακών κυττάρων με φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα.
Ιδιαίτερο ενδιαφέρον, παρουσιάζει το γεγονός ότι η παρακρινική επικοινωνία των
δύο κυτταρικών τύπων ενεργοποίησε όλους τους – υπό μελέτη – δείκτες επιβίωσης
στους φυσιολογικούς ινοβλάστες, οι οποίοι δεν βρίσκονταν σε άμεση επαφή με τα
νανοσωματίδια. Με βάση τα αποτελέσματα των πειραμάτων μας, αλλά και
υποστηρικτικά βιβλιογραφικά δεδομένα, προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, όπως η
IL-1β, συμβάλουν σημαντικά στις παρατηρούμενες αποκρίσεις.
Το Β[α]Ρ εκδήλωσε ήπια κυτταροτοξικότητα, μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις, στις
οποίες επιβεβαιώθηκε και η γενοτοξική του δράση, μέσω της ανίχνευσης σταθερών
προϊόντων προσθήκης (DNA adducts) και θραύσεων του γενετικού υλικού. Επιπλέον,
η αλληλεπίδραση με τα τεχνητά, βιοσυμβατά νανοσωματίδια PLGA ενισχύει τις
επιπτώσεις, ακόμα και λιγότερο κυτταροτοξικών συγκεντρώσεων του ρύπου, πιθανόν
μέσω αύξησης της βιοδιαθεσιμότητάς του. Ωστόσο, οι μη κυτταροτοξικές
συγκεντρώσεις Β[α]Ρ ευνοούν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων Α549, πιθανόν λόγω
ήπιου οξειδωτικού στρες (επαγωγή NrF2), και προκαλούν συσσώρευση του ΗΙF-1α,
μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού PI3Κ/Akt. Η επαγωγή των δύο μεταγραφικών
παραγόντων συνοδεύεται από την μετατόπισή τους στον πυρήνα και τη μεταγραφική
τους ενεργοποίηση. Η απόκριση του ΗΙF-1α στο Β[α]Ρ επιβεβαιώθηκε και στην
επιθηλιακή κυτταρική σειρά καρκινώματος δέρματος, Α431, καθώς και σε
πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικών ινοβλαστών δέρματος και πνεύμονα. Ανάλογα
αποτελέσματα καταγράφηκαν και κατά την επίδραση του Β[α]Ρ, παρουσία επιπλέον
στρεσογόνων συνθηκών, που χαρακτηρίζουν ποικίλες παθοφυσιολογικές καταστάσεις,
όπως η υποξία. Τέλος, η ενσωμάτωση ενός ποσοστού του λιπόφιλου Β[α]Ρ στις
κυτταρικές μεμβράνες και η αλληλεπίδρασή του με διαύλους Ca2+, διαταράσσει την
ομοιόσταση των ιόντων, αυξάνοντας τα βασικά επίπεδα Ca2+ στο κυτταρόπλασμα,
μειώνοντας το περιεχόμενο του ΕΔ και ενισχύοντας το δυναμικό πρόσληψης ιόντων
από το εξωκυττάριο περιβάλλον. Το σημειακό γεγονός της εισροής Ca2+, μέσω των
διαμεμβρανικών διαύλων, ενισχύει άμεσα τη φωσφορυλίωση της Αkt, στο επίπεδο της
πλασματικής μεμβράνης, συμβάλλοντας, με τον τρόπο αυτό, στην πρώιμη συσσώρευση
του HIF-1α.
Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της διδακτορικής διατριβής συνοψίζονται ως εξής:
Ο καρκινικός δείκτης HIF-1α επάγεται άμεσα, παρουσία χαμηλών, μη κυτταροτοξικών
συγκεντρώσεων οργανικών ρύπων. Η απόκριση αυτή είναι συστηματική μεταξύ
διαφορετικών κυτταρικών τύπων και ιστών, συνοδεύεται από τη μεταγραφική του
ενεργοποίηση και μεσολαβείται – σε σημαντικό βαθμό – από το σηματοδοτικό
μονοπάτι επιβίωσης, PI3K/Akt.
Η σύντομη, αλλά επαναλαμβανόμενη, έκθεση στους ρύπους έχει τη δυναμική να
προκαλέσει μακροπρόθεσμες αλλαγές στο σηματοδοτικό δυναμικό των κυττάρων. Όταν
οι μεταβολές αυτές αφορούν μόρια, που προωθούν την κυτταρική επιβίωση, είναι
πιθανό να συνεισφέρουν στη σταδιακή εξαλλαγή του κυτταρικού φαινοτύπου.
Η αλληλεπίδραση μεταξύ επιθηλιακών κυττάρων και ινοβλαστών, μέσω παρακρινικών
παραγόντων, συμβάλει στη διαμόρφωση της τελικής απόκρισης των κυττάρων στους
ρύπους. Συνεπώς, σε in vivo συνθήκες, η παρακρινική επικοινωνία μπορεί να
προκαλέσει μεταβολές ακόμη και σε κύτταρα, τα οποία δεν έρχονται σε άμεση επαφή
με τα σωματίδια.
Η ομοιόσταση των ιόντων ασβεστίου τροποποιείται παρουσία μη κυτταροτοξικών
συγκεντρώσεων οργανικών ρύπων. Συγκεκριμένα, το Β[α]Ρ αυξάνει το δυναμικό
πρόσληψης ιόντων ασβεστίου μέσω της πλασματικής μεμβράνης και η εισροή των
ιόντων ρυθμίζει έμμεσα την επαγωγή του HIF-1α, μέσω ενίσχυσης της φωσφορυλίωσης
της Akt.
(EL)
The effects of atmospheric pollutants on human health constitute an open
research field for many decades. Today, the great majority of the relevant
toxicological and epidemiological studies is mainly focused on particles with
an aerodynamic diameter 10μm (particulate matter, PM), which are considered to
be the most health threatening. Due to their size, these particles are able to
penetrate and accumulate in the respiratory system, while the high
«surface/mass» ratio allows the adsorption of various toxic compounds on their
surface. Transition metals, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), inorganic
ions and various biogenic compounds are thought to be responsible for the toxic
effects of air pollution. The effects of air pollution on human health include
a large number of pathophysiological conditions ranging, from simple skin
irritations and mild allergic reactions, to chronic respiratory problems,
cardiovascular dysfunction and increased cancer risk. Additionally, apart from
the aforementioned physicochemical properties of PM, additional factors, such
as specific conditions of exposure (duration and frequency of exposure
episodes, concentration of pollutants) and individualized sensitivity (age,
pathological background), play a key role in the determination of the final
outcome.
The aim of this Ph.D. thesis was to assess the effects of micro- and
nano-particulate pollutants, of variable composition and complexity, on lung
epithelial cells (namely of the human cell line A549), in order to identify
early changes in cell physiology and signaling, which could contribute to cell
transformation overtime. The responses of A549 were compared to those of human
skin epithelial cells (A431), as well as of primary cultures of normal lung and
dermal fibroblasts. Among the signaling molecules and transcription factors
studied, we particularly focused on Akt kinase and transcription factor HIF-1α,
which promote cell survival and are typical biomarkers of early stages of tumor
development. A second transcription factor, NrF2, was used as a reliable
oxidative stress marker. The three categories of atmospheric pollutants studied
were: 1) a complex mixture of PM2,5-10 collected from an industrial workplace
near Athens, b) a Standard Reference Material (SRM2975) of diesel nanoparticles
(Diesel Exhaust Particles, DEP) and c) the common PAH, benzo[α]pyrene (B[α]P).
B[α]P was selected as a representative component of the organic fraction of the
previous mixtures, in order to investigate, in more detail, its molecular
mechanism of action.
Urban PM were found to significantly decrease cell survival, in a way inversely
related to particle aerodynamic diameter. The cytotoxic effect of the inorganic
fraction was more pronounced compared to the organic fraction, a result that
could be partly attributed to the high concentrations of SO42- and NH4+ ions
detected in the PM mixture. In all cases, reduced cell survival was accompanied
by a parallel decrease in Akt phosphorylation and HIF-1α protein levels.
The main component of the organic fraction of urban PM is DEP nanoparticles.
Low DEP concentrations produced mild oxidative stress conditions, as revealed
by the induction of NrF2, and resulted in an immediate accumulation of HIF-1α.
Repetitive 2-hour exposure of A549 cells to DEP, induced a cumulative increase
of HIF-1α levels, which was maintained for 22 hours, even after DEP removal.
Although, NrF2 was not affected under the same culture conditions, the
concomitant upregulation of its target protein, HO-1, indicates the induction
of NrF2, at earlier time points. Coculture with normal lung fibroblasts, did
not alter the profile of A549 responses. However, using the same experimental
setup, the responses of lung fibroblasts, which were not in direct contact with
the nanoparticles, were of particular interest. Specifically, the paracrine
communication between the two cell types resulted in a substantial induction of
all the survival markers investigated in fibroblasts. Based on these results,
in conjuction with supportive literature data, we propose that pro-inflammatory
cytokines, such as IL-1β, may play a key role to the observed responses.
B[α]P cytotoxicity was mild and detected only at high concentrations. Its
genotoxic effects were confirmed by the formation of stable adducts and by DNA
fragmentation. Interestingly, combined exposure of A549 cells to B[α]P and
manufactured, biocompatible PLGA nanoparticles enhanced the toxic potential of
the pollutant, possibly by increasing its bioavailability. However, low doses
of B[α]P promoted cell proliferation, which was accompanied by upregulation of
NrF2, HIF-1α and Akt. The induction of total protein levels of both
transcription factors was followed by their nuclear accumulation and
transcriptional activation. The response of HIF-1α to B[α]P was confirmed in
the epidermoid carcinoma cell line, A431, as well as in both lung and skin
primary fibroblast cultures. Also, similar results were obtained during
exposure of A549 to B[α]P in the presence of stress conditions, such as
hypoxia, that characterize various lung diseases. Therefore, it seems that
HIF-1α is an early marker of B[α]P effects and, interestingly, its induction
was – at least partially – mediated by the PI3K/Akt pathway. In order to
elucidate the mechanism of HIF-1α induction by B[α]P, we investigated Ca2+
homeostasis. Indeed, we showed that B[α]P disturbs intracellular Ca2+
homeostasis, increasing basal cytoplasmic ion levels, decreasing ion ER content
and, thus, enhancing the potential of extracellular ion uptake. It should be
noted that Ca2+ influx, through the plasma membrane channels, directly triggers
Akt phosphorylation, contributing to the early accumulation of HIF-1α.
In conclusion, the most important results of this doctorate thesis are
summarized as follows:
The cancer biomarker HIF-1α is directly upregulated in the presence of low,
non-cytotoxic concentrations of organic pollutants. This response appears to be
consistent among different cell types and tissues, is mediated – at least in
part – by the PI3K/Akt survival pathway and results in the transcriptional
activation of HIF-1α.
Short-term but repetitive exposure to atmospheric pollutants can possibly cause
long-term alterations in molecular pathways of the cell. In the case that the
affected pathways are implicated in the promotion of cell survival, an
environment which favors gradual cell transformation, could be generated.
The paracrine interaction between epithelial cells and fibroblasts contributes
to the modulation of the final cell response to pollutants. Therefore, under in
vivo conditions, paracrine communication can possibly affect cell types that
are not even in direct contact with the particles.
Calcium homeostasis is disturbed by organic pollutants at low, non-cytotoxic
doses. In particular, B[α]P increases the potential of Ca2+ uptake through the
plasma membrane. This enhanced Ca2+ influx contributes to HIF-1α upregulation
by inducing upstream Akt phosphorylation.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
