Η L-3,4 διυδροξυ-φαινυλ-αλανίνη αποκαρβοξυλάση (L-Dopa αποκαρβοξυλάση, L-Dopa
decarboxylase ή DDC, EC 4.1.1.26) είναι το ένζυμο το οποίο καταλύει την
αποκαρβοξυλίωση της L-Dopa σε ντοπαμίνη. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η
μελέτη της ρύθμισης της L-Dopa αποκαρβοξυλάσης (DDC).
Ο πρώτος άξονας των πειραματικών προσεγγίσεων αφορούσε στη μελέτη της ρύθμισης
έκφρασης της DDC και της κυτταρικής τοπολογίας της πλήρους μήκους DDC, της
εναλλακτικής ισομορφής Αlt-DDC και του φυσικού αναστολέα Aννεξίνη V σε
κυτταρικές σειρές νευρικής και μη νευρικής προέλευσης. Λόγω του εντοπισμού της
DDC και της Alt-DDC σε όλες τις φάσεις διαχωρισμού στις υπό μελέτη κυτταρικές
σειρές ακολούθησε περαιτέρω διερεύνηση του φαινομένου αυτού, μελετώντας της
πιθανότητα απελευθέρωσης της DDC από το μεμβρανικό κλάσμα στα κύτταρα ΗΕΚ-293.
Η διαλυτοποίηση των μεμβρανοσυνδεόμενων μορίων της DDC βρέθηκε ότι εξαρτάται
από τη επίδραση του pH, το χρόνο επώασης και τις συγκεντρώσεις δισθενών
κατιόντων και αναστολέων πρωτεασών κυστεΐνης και σερίνης. Επιπλέον, βρέθηκε ότι
ένα μέρος των μεμβρανοσυνδεόμενων μορίων απελευθερώνεται στο διαλυτό κλάσμα,
υποδεικνύοντας έναν πιθανό μηχανισμό για τη ρύθμιση της ενζυμικής ενεργότητας
του μορίου. Στα πλαίσια της ρύθμισης της έκφρασης και της ενζυμικής ενεργότητας
της DDC, διερευνήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις του ενζύμου με άλλα μόρια, καθώς με
τον τρόπο αυτό μπορούν να προκύψουν σημαντικά συμπεράσματα ως προς τον τρόπο
δράσης του, αλλά και τους παράγοντες που αναστέλλουν την ενεργότητά του. Η
μελέτη του τρόπου δράσης των ενδογενών και χημικών αναστολέων της DDC θεωρείται
πολύ σημαντική για τη κατανόηση της ρύθμισης του ενζύμου. Για το λόγο αυτό,
στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε επίδραση χημικών αναστολέων της ενζυμικής
ενεργότητας της DDC και του ενδογενούς αναστολέα της που έχει απομονωθεί από
ανθρώπινο ορό, σε κυτταρικές σειρές μη νευρικής προέλευσης. Για την περαιτέρω
μελέτη του φαινομένου, σχεδιάστηκε η μελέτη της αλληλεπίδρασης της DDC και της
Αlt-DDC με την Aννεξίνη V σε ευκαρυωτικό σύστημα CHO κυττάρων (Chinese Hamster
Ovary cells).
Η DDC εμπλέκεται σε παθολογικές καταστάσεις, όπως στη νόσο του Parkinson, τον
καρκίνο και τη σχιζοφρένεια. Για τους παραπάνω λόγους, η μελέτη της ρύθμισης
της DDC παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, διότι θα μπορούσε να συμβάλλει σε
νέες πειραματικές προσεγγίσεις, οι οποίες θα έχουν ως τελικό στόχο την ανάπτυξη
νέων φαρμακολογικών και θεραπευτικών μέσων για την καταπολέμηση
νευροεκφυλιστικών και νεοπλασματικών νόσων.
(EL)
L-3,4-dihydroxyphenyl-alanine decarboxylase (L-Dopa decarboxylase, or DDC, EC
4.1.1.26) is the enzyme which catalyzes the decarboxylation of L-Dopa to
dopamine. The aim of the present dissertation was the study of the regulation
of L-Dopa decarboxylase.
The first axis of the related experimental approaches was to study the
regulation of DDC expression and the cellular topology of the full-length DDC,
the alternative isoform Alt-DDC and its endogenous inhibitor Annexin V in cell
lines of neural and non-neural origin. Due to the localization of DDC and
Alt-DDC in all separation phases in the studied cell lines, we proceeded to
further investigation of this phenomenon by studying the possibility of DDC
solubilization from membrane fraction in HEK-293 cells. Solubilization of
membrane-associated DDC was observed in a pH and time-dependent manner and was
affected by divalent cations and serine and cysteine protease inhibitors.
Furthermore, our data indicated that only a portion of the membrane-associated
DDC molecules were released into the soluble fraction, suggesting the
involvement of a possible regulated mechanism in the enzymatic activity of the
molecule.
In order to study DDC expression and enzymatic activity regulation, we
investigated the interactions of the enzyme with other molecules. The study of
DDC inhibition by endogenous and chemical inhibitors is very important for
understanding the enzyme regulation mechanism. For this reason, it was
investigated the effect of chemical inhibitors of DDC enzymatic activity and
endogenous inhibitor isolated from human serum in cell lines of non-neural
origin, in the present work. To further study the regulation phenomenon, we
proceeded to the investigation of the interaction of DDC and ALT-DDC with
Annexini V system in eukaryotic CHO cells (Chinese Hamster Ovary cells).
DDC has been implicated in many pathological conditions such as Parkinson’s
disease, cancer and schizophrenia. For these reasons, the study of DDC
regulation is of particular interest, because it could contribute to the
development of new experimental approaches and ultimately of new
pharmacological and therapeutic tools against neurodegenerative and neoplastic
diseases.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
