Οι κρανιοσκελετικές δυσπλασίες μπορούν να διακριθούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες:
τις σκελετικές δυσπλασίες και τις κρανιοσυνοστεώσεις. Η κρανιοσυνοστέωση, η
πρόωρη σύντηξη των κρανιακών ραφών, διαιρείται σε μη συνδρομική και συνδρομική.
Τα συχνότερα σύνδρομα κρανιοσυνοστέωσης Muenke, Crouzon και Crouzon με
μελανίζουσα ακάνθωση, Apert, Pfeiffer, Saethre-Chotzen και CFNS οφείλονται σε
μεταλλαγές στα γονίδια FGFR1-3, TWIST1 και EFNB1.
Οι υποδοχείς FGFR1-3 και οι μεταγραφικοί παράγοντες TWIST1 και RUNX2 παίζουν
ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών.
Πιθανόν να αλληλοεπιδρούν κατά την οστεοβλαστογένεση και τη δημιουργία των
κρανιακών ραφών, δηλαδή να συμμετέχουν στο ίδιο σηματοδοτικό μονοπάτι, αν και
λόγω των αμφιλεγόμενων πειραματικών δεδομένων, δεν είναι ακόμα πλήρως γνωστός ο
τρόπος. Η κρανιοσυνοστέωση λόγω μεταλλαγών στον FGFR2 και ίσως στον TWIST1
οφείλεται σε πρώιμη ή προβληματική διαφοροποίηση των οστεοβλαστών στα
οστεογενετικά μέτωπα, στην οποία μπορεί να εμπλέκεται και η αύξηση του
πολλαπλασιασμού τους. Ενδεχομένως όμως, να προκύπτει μέσω διαφορετικών
μηχανισμών. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι :
Α) Η ανίχνευση της υποκείμενης γενετικής βάσης σε ασθενείς με κρανιοσκελετικές
ανωμαλίες, η οποία θα συμβάλλει στο βέλτιστο και λεπτομερή συσχετισμό γονοτύπου-
φαινοτύπου και στην καλύτερη διαχείριση των ασθενών.
Β) Η κατανόηση του σηματοδοτικού μονοπατιού που οδηγεί σε κρανιοσυνοστέωση. Για
το λόγο αυτό επιλέχθηκαν να διερευνηθούν τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των
μεταγραφικών παραγόντων RUNX2 και TWIST1, που είναι γνωστό ότι παίζουν
σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών, καθώς και του
γονιδίου COL1A1, που αποτελεί δείκτη διαφοροποίησης των οστεοβλαστών μεταξύ
ασθενών με κρανιοσυνοστέωση, συνδρομικού τύπου ή μη και φυσιολογικών ατόμων σε
καλλιέργειες δερματικών ινοβλαστών που καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες ανάπτυξης.
Γ) Η προτυποποίηση της καλλιέργειας των δερματικών ινοβλαστών ως πιθανό μοντέλο
μελέτης της διαφορικής έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την πρόωρη σύντηξη
των κρανιακών ραφών, του οποίου η χρησιμότητα αξίζει να διερευνηθεί για δύο
βασικούς λόγους: τον αναπτυξιακό συσχετισμό τους με τους οστεοβλάστες,
αντιπροσωπεύοντας έναν σχετικό με αυτούς κυτταρικό τύπο και την ευκολία
χειρισμού τους.
Για την παρούσα μελέτη συλλέχθηκαν βιολογικά υλικά (αίμα/δέρμα) από 48 ασθενείς
με κρανιοσκελετικές ανωμαλίες και 2 φυσιολογικά ως προς την κρανιοσυνοστέωση
άτομα (πλαγιοκεφαλία εκ θέσεως και φυσιολογικό δείγμα ελέγχου) που προσήλθαν
στο Ελληνικό Κρανιοπροσωπικό Κέντρο του Νοσοκομείου ΜΗΤΕΡΑ.
Ο μοριακός έλεγχος που πραγματοποιήθηκε με ανάλυση αλληλουχίας, ΑFLP ή/και MLPA
επιλεγμένων γενετικών τόπων, ανέδειξε μεταλλαγές σε 14/46 ασθενείς με
κρανιοσυνοστέωση (μοριακή διάγνωση σε ποσοστό περίπου 30%). Βρέθηκαν συνολικά 9
διαφορετικές μεταλλαγές στα γονίδια FGFR2, FGFR3, TWIST1 και EFNB1, εκ των
οποίων οι 3 ήταν νέες, μια ετερόζυγη έλλειψη του γονιδίου TWIST1 και ένας
πολυμορφισμός στον FGFR3. Δύο από τις νέες μεταλλαγές, η παρανοηματική E125K
και η πλαισιοτροποποιητική L240fsX79, βρίσκονται στο γονίδιο EFNB1. Η μεταλλαγή
E125K στην περιοχή ephrin της EFNB1 αναμένεται να παρεμποδίζει την
αλληλεπίδρασή της με τους υποδοχείς της Eph. Η μεταλλαγή L240fsX79 οδηγεί στη
δημιουργία μικρότερης, πιθανόν ασταθούς πρωτεΐνης. Η τρίτη νέα μεταλλαγή, η
παρανοηματική L138P μέσα στην υψηλά συντηρημένη περιοχή HLH του παράγοντα
TWIST1 πιθανόν να παρεμποδίζει την πρόσδεσή του στο DNA.
Η σημασία του μοριακού ελέγχου ασθενών με κρανιοσυνοστέωση είναι μεγάλη γιατί
επιτρέπει το βέλτιστο και λεπτομερή συσχετισμό γονοτύπου-φαινοτύπου για κάθε
ένα από τα σύνδρομα και μπορεί να οδηγήσει σε μοριακή διάγνωση, επιτρέποντας
τον ορθό χαρακτηρισμό του συνδρόμου, την κατάλληλη κλινική αντιμετώπιση του
ασθενούς, την παροχή γενετικής συμβουλευτικής και τον προγεννητικό έλεγχο.
Η μελέτη των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων RUNX2, TWIST1 και COL1A1
που είναι γνωστό ότι εκφράζονται στους οστεοβλάστες, παίζοντας σημαντικό ρόλο
στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίησή τους, πραγματοποιήθηκε σε δερματικούς
ινοβλάστες από ασθενείς με συνδρομική κρανιοσυνοστέωση, που έφεραν μεταλλαγές
είτε στo γονίδιο FGFR2, είτε στο TWIST1, από ασθενείς με μη συνδρομική
συνοστέωση, από έναν ασθενή με πλαγιοκεφαλία εκ θέσεως και ένα φυσιολογικό
άτομο, μετά από καλλιέργεια των κυττάρων σε συνθήκες ανάπτυξης. Στους ασθενείς
διαπιστώθηκαν διαφορές των επιπέδων έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων, οι οποίες
αν και μικρές υποδηλώνουν ένα διαφορετικό πρότυπο έκφρασης, τόσο μεταξύ
παθολογικών και φυσιολογικών δειγμάτων όσο και ανάμεσα στα παθολογικά δείγματα,
συγκρινόμενα μεταξύ τους. Αν και απαιτείται περαιτέρω μελέτη της έκφρασης των
γονιδίων RUNX2, TWIST1 και COL1A1 στους δερματικούς ινοβλάστες, τα πειραματικά
αποτελέσματα της παρούσας εργασίας δείχνουν ότι οι παράγοντες αυτοί εμπλέκονται
στο σηματοδοτικό μονοπάτι της κρανιοσυνοστέωσης αλλά με διαφορετικό τρόπο,
ανάλογα με την περίπτωση. Αντίθετα με τις προσπάθειες δημιουργίας ενός
απλοποιημένου, ενιαίου μοντέλου το οποίο θα ισχύει σε όλες τις περιπτώσεις
κρανιοσυνοστέωσης, φαίνεται ότι τα σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται
τόσο από τις μεταλλαγές του FGFR2, του TWIST1, αλλά και στις μη συνδρομικές
περιπτώσεις είναι πολύ διαφορετικά μεταξύ τους. Τα αποτελέσματα αυτά είναι η
πρώτη στοχευμένη μελέτη της έκφρασης των γονιδίων RUNX2, TWIST1 και COL1A1 σε
δερματικούς ινοβλάστες από ασθενείς με συνδρομική ή μη συνδρομική συνοστέωση
και από άτομα χωρίς συνοστέωση.
(EL)
Cranioskeletal dysplasias can be divided into two major groups: skeletal
dysplasias and craniosynostosis. Craniosynostosis, the premature fusion of
cranial sutures is further divided into syndromic and non syndromic. The common
craniosynostosis syndromes Muenke, Crouzon/Crouzon with acanthosis nigricans,
Apert, Pfeiffer, Saethre-Chotzen and CFNS are caused by mutations in FGFR1-3,
TWIST1 and EFNB1 genes.
FGF receptors 1-3 as well as the transcription factors TWIST1 and RUNX2 play
very important roles in controlling osteoblast proliferation and
differentiation. Probably, they interact during osteoblastogenesis and suture
formation, thus belonging to the same pathway, even though the way they
interact is not clear, due to inconsistency of experimental results.
Craniosynostosis induced by FGFR2 and maybe TWIST1 mutations is the result of
premature or improper osteoblast differentiation at bone fronts in which
increased cell proliferation maybe involved as well, following several
different mechanisms.
The aims of this study are:
Α) Detection of underlying genetic cause in patients with cranioskeletal
dysplasias, which will contribute in more accurate genotype-phenotype
correlation as well as in proper patient management.
Β) Understanding the signaling pathway leading to craniosynostosis. In order to
succeed this we chose to study relative expression levels of the transcription
factors RUNX2 and TWIST1, known to play important roles in the regulation of
osteoblast differentiation, as well as COL1A1, as a differentiation marker, in
patients with syndromic or non syndromic craniosynostosis and normal
individuals, in skin fibroblast cell cultures under growth conditions.
C) Development of skin fibroblast cultures as a potential model for the study
of differential expression of genes related to premature suture fusion. This
model’s utility is worth evaluating for two reasons: fibroblasts are
developmentally related to osteoblasts, therefore representing a particularly
relevant cell type and they can be easily cultured and manipulated.
For this study biological samples (blood/skin) were collected from 48 patients
with cranioskeletal anomalies and from 2 normal regarding synostosis
individuals (positional plagiocephaly and normal control sample), who presented
in the Hellenic Craniofacial center at MITERA Hospital.
Molecular analysis of selected genetic loci using sequencing, AFLP and/or MLPA
revealed mutations in 14/46 craniosynostosis patients (molecular diagnosis at
~30%). In total, 9 different mutations were found in FGFR2, FGFR3, TWIST1 and
EFNB1 genes, of which 3 were novel, a heterozygous TWIST1 gene deletion and a
FGFR3 polymorphism. Two of the novel mutations, the missense E125K and the
frameshift L240fsX79, are within EFNB1 gene. E125K mutation, which lies within
ephrin domain of EFNB1, is expected to disrupt the interaction between the Eph
receptor and ephrin B1 ligand. L240fsX79 mutation results in a truncated,
probably unstable protein product. The third novel mutation, missense L138P
which lies within highly conserved HLH domain of TWIST1, possibly results in
loss of DNA binding capacity of the transcription factor.
Molecular genetic testing of craniosynostosis patients is of great importance
because it allows accurate genotype-phenotype correlation and can lead to
molecular diagnosis, thus allowing proper patient’s management, genetic
counseling and prenatal diagnosis.
Study of relative expression levels of RUNX2, TWIST1 and COL1A1 genes, known to
be expressed in osteoblasts and play important role in their proliferation and
differentiation, was performed in skin fibroblasts from patients with syndromic
craniosynostosis, carrying mutations either in FGFR2 or TWIST1 genes, from
patients with non syndromic synostosis, from one patient with positional
plagiocephaly and from a normal individual. Cells were cultured under growth
conditions.
The differences in gene expression levels observed in our patients, although
relatively small, reveal a differentiated expression pattern between pathogenic
and normal samples, as well as among pathogenic samples compared to each other.
Even though further studies of RUNX2, TWIST1 and COL1A1 gene expression are
required in skin fibroblasts, experimental results of this study point out that
all of these genes are involved in craniosynostosis signaling pathway, but in
different ways, depending on the context.
As opposed to the efforts in creating a simple, unifying model, applied to all
craniosynostosis cases, it seems that signaling pathways triggered either by
FGFR2 and TWIST1 mutations or in isolated synostosis cases are very different
compared to each other.
These results are the first targeted study of RUNX2, TWIST1 and COL1A1 gene
expression in skin fibroblasts from patients with syndromic or non syndromic
craniosynostosis and from individuals without synostosis.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
