Πρωτεωμική προσέγγιση στην ανάλυση ρυθμιστικών σηματοδοτικών πορειών: ερυθροειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες

Πρωτεωμική προσέγγιση στην ανάλυση ρυθμιστικών σηματοδοτικών πορειών: ερυθροειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες

Παπαγεωργίου Δημήτριος (EL)

born_digital_thesis

Διδακτορική Διατριβή (EL)

Doctoral Dissertation (EN)

2013

Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός νέων πρωτεϊνικών συμπλόκων του ερυθροποιητικού μεταγραφικού παράγοντα GATA-1, μέσω της εφαρμογής της μεθόδου in vivo βιοτινυλίωσης σε σύζευξη με φασματομετρία μάζας. Προκειμένου να γίνει ο χαρακτηρισμός των νέων πρωτεϊνικών συμπλόκων, βελτιώσαμε τη μέθοδο της in vivo βιοτινυλίωσης η οποία περιλαμβάνει την ομοιοπολική πρόσδεση βιοτίνης σε μια βραχεία αμινοξική αλληλουχία (15-23 αα) συζευγμένη με την υπό μελέτη πρωτεΐνη και την μετέπειτα κατακρήμνιση της βιοτινυλιωμένης πρωτεΐνης από σφαιρίδια στρεπταβιδίνης. Η βελτιωμένη μέθοδος οδήγησε στην ταυτοποίηση νέων αλληλεπιδρωσών πρωτεϊνών με τη GATA-1 όπως και ένα αριθμό πρωτεϊνών που κατακρημνίζονται μη ειδικά εξαιτίας της ύπαρξης νουκλεϊκών οξέων στα πυρηνικά εκχυλίσματα και οι οποίες είναι ικανές να οδηγήσουν στη ταυτοποίηση ψευδών θετικών αλληλεπιδράσεων. Ως ένα τέτοιο παράδειγμα ψευδούς θετικής αλληλεπίδρασης, παρουσιάζεται η αλληλεπίδραση της GATA-1 με τις πρωτεΐνες TAF, ενώ παρουσιάζονται και αποτελέσματα που δείχνουν ότι η χρήση ειδικών νουκλεασών για την διάσπαση των νουκλεϊκών οξέων σε πυρηνικά εκχυλίσματα μειώνει αισθητά τις μη ειδικές πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Επίσης, από τα αποτελέσματα της φασματομετρίας μάζας αναγνωρίσθηκε η DNA μεθυλοτρανσφεράση Ι ως αλληλεπιδρώσα με τη GATA-1 πρωτεΐνη μαζί με τους μεταγραφικούς παράγοντες ZBP-89 και ZNF143. Η ύπαρξη του συγκεκριμένου συμπλόκου επιβεβαιώθηκε από σειρά πειραμάτων ανοσοκατακρήμνισης. Με τη χρήση απαλειπτικών μεταλλάξεων της DNMT-1 βρέθηκε η περιοχή PBD ως υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση με το σύμπλοκο GATA-1/ZBP-89/ZNF143. Ο χαρακτηρισμός της περιοχής που είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση επιτρέπει τη διατάραξη του πρωτεϊνικού συμπλόκου με σκοπό τη διασαφήνιση της λειτουργικής σημασίας του πρωτεϊνικού συμπλόκου και του σκοπού που επιτελεί στην ερυθροποίηση. (EL)

GATA-1 is a key hematopoietic transcription factor that is required for erythrocyte differentiation. GATA-1 can positively or negatively regulate erythroid genes through its ability to form multiple protein complexes. In this thesis we sought to discover new GATA-1 protein complexes by using improved in vivo biotinylation tagging coupled to mass spectrometry. In vivo biotinylation involves the covalent attachment of a biotin group to a small peptide tag (15-23 aa) fused to the protein of interest, by the bacterial biotin ligase BirA and the very high affinity binding of the biotin-tagged protein by streptavidin. We show that including Nonidet P-40 in the nuclear extract preparation reduces background caused by the binding of endogenously biotinylated proteins. We also show that the use of alternative nuclear extract methods, results in more efficient nuclear protein extraction of GATA-1 protein compared to the commonly used high salt extraction method. By using this improved biotinylation tagging method we identify the novel interacting GATA-1 protein DNA methyltransferase I while being able to discard false positive identified interactions. We present an example of the latter by showing how GATA-1 interactions with TAF proteins as identified by mass spec, disappear upon nuclease digestion of nucleic acids from the nuclear extracts. By applying the biotinylation tagging approach for the reverse purification of DNMT1 protein complexes, we confirmed the interaction with GATA-1 and we further identified novel interactions with key hematopoietic transcription factors such as ZBP-89, ZNF143, Gfi-1b, FOG-1 and others. Validation of these interactions further suggested that DNMT1 forms a core complex with ZBP-89 and ZNF143 and subcomplexes with GATA-1, FOG-1 and Gfi-1b. In order to map the DNMT-1 domains necessary for the interaction with transcription factors, DNMT1 deletion mutants of the protein were used to show that the domain responsible for interaction is the PCNA binding domain (PBD). This will be further used in order to unravel the biological significance of the GATA-1 DNMT-1 interaction. (EN)

Greek

Σχολή Θετικών Επιστημών » Τμήμα Χημείας » Τομέας ΙΙ [Οργανική Χημεία – Οργανική Χημική Τεχνολογία – Χημεία Τροφίμων]

Βιβλιοθήκη και Κέντρο Πληροφόρησης » Βιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών

https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

University of Athens

Pergamos Digital Library

Doctoral Dissertation