Η παρούσα μελέτη διεξήχθη στα πλαίσια του ευρωπαϊκού προγράμματος
“MICROSMETICS”, στόχος του οποίου ήταν η ανακάλυψη και η αξιοποίηση στον τομέα
των καλλυντικών, καινοτόμων προϊόντων που προέρχονται από τη παγκόσμια
βιοποικιλότητα, χρησιμοποιώντας σύγχρονες τεχνολογίες στους τομείς της
βιοτεχνολογίας, της χημείας των φυσικών προϊόντων και της εφαρμοσμένης
μικροβιολογίας.
Το συγκεκριμένο ερευνητικό πρόγραμμα περιλαμβάνει την ανακάλυψη νέων φυσικών
προϊόντων προερχόμενων από την παγκόσμια μικροβιακή βιοποικιλότητα. Ήδη
υπάρχουσες συλλογές καλλιεργειών μυκήτων και ακτινομυκήτων αξιοποιήθηκαν,
ενσωματώνοντας σύγχρονες πλατφόρμες (in silico και in vitro) για την
ορθολογική και στοχευμένη επιλογή τον πιο ελπιδοφόρων στελεχών. Προηγμένες
αναλυτικές προσεγγίσεις και τεχνικές εφαρμόστηκαν για την επιταγχυνόμενη και
αποτελεσματικότερη απομόνωση και ταυτοποίηση των βιοδραστικών μεταβολιτών.
Ενσωματώθηκε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δοκιμών για την αξιολόγηση της
αντιγηραντικής δράσης, και πιο συγκεκριμένα της αντιοξειδωτικής, προστατευτικής
και λευκαντικής δράσης. Ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε στην επιλογή και
βελτιστοποίηση των τεχνολογιών καλλιέργιας των μικροοργανισμών σε πιλοτική
κλίμακα, ώστε να έιναι επιτυχής η παραγωγή σε μεγάλη κλίμακα των νέων δραστικών
πρώτων υλών, με σκοπό την εκμετάλλευση τους από τη βιομηχανία των καλλυντικών.
Για το σκοπό αυτό, δημιουργήθηκε ένα ακριβές λειτουργικό μοντέλο πρόβλεψης για
όλες τις γνωστές καλλυντικές λειτουργίες. Επιπροσθέτως, κατασκευάστηκαν ομόλογα
μοντέλα ειδικών υποδοχέων-στόχων (τυροσινάση, ελαστάση, υαλουρονιδάση και
κολλαγενάση) για τις οποίες έχουν ήδη αναπτυχθεί in vitro δοκιμές. Πάνω από
40,000 μικροβιακοί μεταβολίτες δοκιμάστηκαν in vitro. Συνδυάζοντας όλα τα
αποτελέσματα με το λειτουργικό μοντέλο πρόβλεψης, επιλέχθηκαν 110
μικροοργανισμοί, που ενδεχομένως έχουν την δυνατότητα να παράγουν τους εν λόγω
μεταβολίτες ή ανάλογα αυτών.
Ανάμεσα στους 110 μικροοργανισμούς, περιλαμβάνονται 54 μύκητες και 56
ακτινομύκητες που προέρχονται από τη παγκόσμια μικροβιακή βιοποικιλότητα
(συμπεριλαμβανομένων στελεχών από Αλάσκα, Ισπανία, Νέα Καληδονία, Χαβάη, Νότια
Αφρική κλπ.). Αυτά τα στελέχη καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικά καλλιεργητικά μέσα
με σκοπό το κάθε στελεχος να παράγει δέκα διαφορετικά εκχυλίσματα και με αυτόν
τον τρόπο να παραχθεί πληθώρα δευτερογενών μεταβολιτών. Συνολικά παρήχθησαν
1082 εκχυλίσματα (614 εκχυλίσματα ακτινομυκήτων και 425 εκχυλίσματα μυκήτων),
τα οποία τοποθετήθηκαν σε 96-τρυπες πλάκες, ώστε να ακολουθηθεί το “high
throughput screening”.
Πραγματοποιήθηκε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δοκιμών για την αξιολόγηση της
αντιγήραντικής, αντιοξειδωτικής, προστατευτικής και λευκαντικής δράσης όλων των
παραγόμενων παρασκευασμάτων. Για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης των
1082 εκχυλισμάτων, πραγματοποιήθηκαν οι δοκιμές DPPH και ABTS. Η προστατευτική
δράση στο δέρμα μελετήθκε μετρώντας φασματοφωτομετρικά τις ανασταλτικές
ιδιότητες των δειγμάτων έναντι των ενζύμων ελαστάση, κολλαγενάση και πρωτεάση.
Η λευκαντική δράση αξιολογήθηκε βάσει της ικανότητας αναστολής του ενζύμου της
τυροσινάσης, χρησιμοποιώντας την L-DOPA ως υπόστρωμα. Τέλος, για λόγους
ασφάλειας, μελετήθηκε η κυτταροτοξικότητα των εκχυλισμάτων στις κυτταρικές
σειρές A2058 (κύτταρα ανθρώπινου μελανώματος) και HepG2 (ανθρώπινα ηπατικά
κύτταρα καρκινώματος) με την μέθοδο MTT. Τα αποτελέσματα των παραπάνω
βιοδοκιμών επέτρεψαν την τελική διαλογή των δραστικών και μη τοξικών
εκχυλισμάτων.
Μεταξύ των 1082 εκχυλισμάτων, 104 επέδειξαν σημαντική δράση σε τουλάχιστον ένα
στόχο. Ανάμεσα στα 104 εκχυλίσματα, τα 75 ανήκαν σε ακτινομύκητες και τα 29 σε
μύκητες. Αξίζει να σημειωθεί ότι μόλις το 11% και 6% όλων των εκχυλισμάτων
ακτινομυκήτων και μυκήτων αντίστοιχα, χαρακτηρίστηκαν ως μη τοξικά και
δραστικά. Περαιτέρω ανάλυση των αποτελεσμάτων επέδειξε και πιθανή συμβολή της
επιλογής του καλιεργητικού μέσου στη μεταβολή της δράσης.
Το επόμενο στάδιο της μελέτης, ήταν η επιλογή των 20 πιο δραστικών στελεχών που
πραγματοποιήθηκε μέσω της αξιολόγησης του χημικού προφίλ των 104 εκχυλισμάτων
χρησιμοποιώντας μία στρατηγική που συνδυάζει UHPLC και LC-HRMS, σε θετικό και
αρνητικό ιονισμό, με στατιστικές μεθόδους πολλών μεταβλητών. Παράλληλα
πραγματοποιήθηκε επανάληψη όλων των βιολογικών δοκιμών για αυτά τα 104 δραστικά
εκχυλίσματα, με στόχο να αποκλειστούν τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Τα
χρωματογραφήματα αναλύθηκαν και παρατηρήθηκε μία θετική συσχέτιση μεταξύ των
προφιλ των εκχυλισμάτων και των βιολογικών δράσεων. Έτσι επιλέχθηκαν τα 20 πιο
δραστικά εκχυλίσματα (19 στελέχη καλλιεργούμενα με 14 διαφορετικά καλλιεργητικά
μέσα), ανάμεσα στα οποία βρίσκονταν 8 από στελέχη μυκήτων και 12 από στελέχη
ακτινομύκητων, για την καλλιέργειά τους σε μεγάλη κλιμακα και για την
επαλήθευση της δράσης τους.
Τα στελέχη καλλιεργήθηκαν στο 1 L με το βέλτιστο καλλιεργητικό μέσο και
παρήχθησαν 66 εκχυλίσματα, εφαρμόζοντας διάφορα πρωτόκολλα εκχύλισης, με στόχο
την βιοκατευθυνόμενη βελτιστοποίηση της μεθόδου εχύλισης. Ανάμεσα σε αυτά τα
περισσότερα επαλήθευσαν την δράση τους κατά την ανακαλλιέργειά τους στο 1 L,
ενώ άλλα απέτυχαν. Το προφίλ των περιεχόμενων δευτερογενών μεταβολιτών
μελετήθηκε με τη βοήθεια TLC, UPLC και LC-HRMS.
Το εκχύλισμα οξικού αιθυλεστέρα του Cercospora sp. (στέλεχος CF-223709)
κατέδειξε την μεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση (70.76% ± 1.28 ποσοστό δέσμευσης
της ελεύθερης ρίζας DPPH, στα 200 μg/ml), ενώ τo εκχύλισμα οξικού αιθυλεστέρα
που προήλθε από υγρή υγρή εκχύλιση (EtOAc_LL) του Streptomyces hygroscopicus
subsp. angustmyceticus (στέλεχος CA-129531) κατέδειξε την πιο σημαντική
λευκαντική δράση (74.35% ± 0.48 αναστολή του ενζύμου της τυροσινάσης, στα 300
μg/ml). Συνεπώς τα προαναφερθέντα εκχυλίσματα στελεχών επιλέχθηκαν για την
περαιτέρω τους μελέτη και απομόνωση και ταυτοποίηση των βιοδραστικών
μεταβολιτών τους.
Η ανάλυση και κλασμάτωση των εκχυλισμάτων αυτών πραγματοποιήθηκε
χρησιμοποιώντας ταυτόχρονα κλασικές χρωματογραφικές μεθόδους (ημι-
παρασκευαστική HPLC), καθώς και πιο καινοτόμες τεχνικές, όπως UPLC, SFC-MS και
FCPC. Όλα τα παραγόμενα κλάσματα μελετήθηκαν ως προς την αντιοξειδωτική και
λευκαντική τους δράση και τα πιο δραστικα από αυτά επιλέχθηκαν για περαιτέρω
κλασμάτωση είτε για ταυτοποίηση της δομής του κύριου μεταβολίτη που περιείχαν.
Το σύνολο των φασματοσκοπικών δεδομένων (LC-HRMS και 1D & 2D NMR) καταγράφηκε
για όλες τις απομονωμένες ενώσεις. Αποτέλεσμα όλων αυτών ήταν η
βιοκατευθυνόμενη απομόνωση και ταυτοποιήση των κατόθι:
• τριών δραστικών μεταβολιτών, στους οποίους οφείλεται η αντιοξειδωτική
δράση του στελέχους CF-223709, οι οποίοι περιλαμβάνουν τις γνωστές ενώσεις
φουλβικό οξύ (IC50=21.58 μg/ml, δοκιμή DPPH) και βιναξανθόνη (35.08 μg/ml,
δοκιμή DPPH), καθώς και ένα νέο φυσικό προϊόν, παράγωγο του φουλβικού οξέος, με
μοριακό τύπο C13H12O6 (IC50=18.99 μg/ml, δοκιμή DPPH).
• δύο δραστικών μεταβολιτών, που συνεισφέρουν στην λευκαντική δράση του
στελέχους CA-129531 και ταυτοποιηήθηκαν ως τριχοστατίνη Α και τριχοστατικό οξύ.
Αναμένεται ότι ακολουθώντας τα καλύτερα πρωτόκολλα εκχύλισης για το κάθε
επιλεγμένο στέλεχος και παρόμοιες μεθόδους κλασμάτωσης, θα γίνει εφικτή η
ανακάλυψη περισσότερων ικανών υποψηφίων που θα αξιοποιηθούν σε βιομηχανικό
επίπεδο. Η συγκεκριμένη μελέτη αποτελεί μία δυνατή απόδειξη ότι η παγκόσμια
μικροβιακή ποικιλότητα και οι μεταβολίτες που παράγει μπορούν να έχουν
επιτυχημένες εφαρμογές στην παγκόσμια βιομηχανία καλλυντικών.
(EL)
The present study was carried out towards an EU funded project, named
“MICROSMETICS”. The aim of MICROSMETICS project was to discover and carry to
the stage of development innovative products in the area of cosmeceuticals
originating from global biodiversity using emerging and state of the art
technologies in the field of biotechnology, natural products chemistry and
applied microbiology.
More specifically, MICROSMETICS scientific concept involved the discovery of
novel natural products originating from global microbial biodiversity. Already
existing culture collections of fungi and actinomycetes were exploited
incorporating modern high throughput platforms (in silico & in vitro) for the
rational and targeted selection of the most promising strains. Advanced
analytical approaches and techniques were applied for the efficient,
accelerated and advantageous isolation and identification of natural
constituents as well as the quality assessment of the lead products. A broad
spectrum of bioassays was incorporated for the evaluation of anti-ageing, more
specifically anti-oxidant, skin-protecting, and skin-whitening activity of all
derived products. Attention was given to the selection and optimization of
fermentation technologies used at pilot scale for the production of new active
raw materials to be used in the cosmetic industry.
In order to achieve those goals, as a first step a Rational Drug Design
approach has been developed. Starting from the CosIng Repository of the
European Commission, an accurate functional prediction model was created for
all known cosmetic functions. Additionally it was constructed the homology
models of specific cosmetic target receptors (tyrosinase, elastase,
hyaluronidase and collagenase) for which the appropriate in vitro tests have
already been developed. More than 40.000 known microbial metabolites were
processed through a consensus scoring prediction protocol using: a) functional
prediction model b) virtual screening procedure for the above 4 selected
receptors c) similarity search based on all known molecules from literature
that bind to the specific receptors and d) toxicological profile filtering.
Combining all the results with functional prediction model and toxicological
profile filtering, 110 microorgnanisms were selected that can produce those
metabolites or analogues.
Among them 54 fungi and 56 actinomycetes from the global biodiversity
(including strains from Antarctica, Alaska, Spain, New Caledonia, Hawaii, South
Africa, Comoros Island etc.) were cultivated under “nutritional arrays”
(different culture conditions) in order each single strain to produce ten
different extracts and thus exploit all the potential chemodiversity that
microorganisms can produce. In total 1082 sample extracts (614 actinomycetous
extracts & 425 fungal extracts) have been generated, then were filtered and
prepared in 96 barcoded well format and were forwared to high throughput
screening.
Initially for the safety of those extracts cytotoxicity was evaluated on A2058
and HepG2 cell lines by the MTT method. The results of the above bioassays
permitted the elimination of all toxic and non active extracts.
A broad spectrum of bioassays have being incorporated for the evaluation of
anti-ageing, more specifically anti-oxidant, skin-protecting, and
skin-whitening activity of all derived products. For the evaluation of the 1082
extracts concerning the antioxidant activity the DPPH and ABTS assays were
used. Skin-protecting was evaluated by measuring spectrophotometrically the
inhibitory properties of samples against enzymes which are related to the
elasticity and moisture of the skin (elastase, collagenase, and protease). The
skin whitening activities were determined by the tyrosinase assay, using L-DOPA
as substrate.
Among the 1082 extracts the top 104 extracts demonstrated significant activity
in at least one target and were forwarded to metabolomics analysis. Among the
104 extracts, 75 belonged to actinomycetes and 29 to fungi. Only the 11% and 6%
of all the actinomycetes’ and fungi’s extracts respectively were non toxic and
active. Data analysis revealed the likely effect in the activity that the
culture medias may have.
In order to select the 20 most active extracts, a strategy combining
UHPLC/Orbitrap-HRMS, in positive and negative modes, with multivariate
statistical methods was applied. In parallel, biological assays were repeated
to exclude the false positive samples and select the most active ones. All
derived chromatograms have been analyzed and a positive correlation between the
profiles of the extracts with the bioassays’ results was observed. Thus,
through analysis the 20 most promising extracts (19 strains under 14 conditions
have been forwarded for large-scale cultivation and for confirmation of the
activity. In total 8 fungal and 12 actinomycetous extracts were selected for
further investigation.
All strains were cultivated with the optimum media for producing the active
metabolites in a 1 L scale fermentation and 66 extracts were generated, using
various extraction protocols in order to optimize the extraction method. Among
them some confirmed the activity while in others the large scale cultivation
failed to produce the same activity and metabolites and thus their cultivation
is currently re-evaluated. The chemical profile of those extracts was examined
by using TLC, UPLC and LC-HRMS.
The EtOAc extract of Cercospora sp. (strain CF-223709) with the most
siginificant antioxidant activity (70.76% ± 1.28 free radicals scavenging, DPPH
assay) and the EtOAc_LL extract of Streptomyces hygroscopicus angustmyceticus
(strain CA-129531) with the most significant skin-whitening activity (74.35% ±
0.48 inhibition of the tyrosinase enzyme), were chosen in order to isolate
their bioactive metabolites and elucidate their structures.
The profiling and fractionation of those extracts was performed using both
classical chromatographic methods (semi-prep HPLC), as well as more innovative
techniques, like UPLC, SFC-MS and FCPC. All the fractions were evaluated for
their antioxidant and skin-whitening activity and the most active ones were
chosen for further fractionation or to direct elucidation of the structure of
the main metabolite they contained. The full set of spectroscopic data (LC-HRMS
and 1D & 2D NMR) was recorded for all isolated compounds. During the process of
the bio-guided isolation we managed to isolate and identify:
• three bioactive metabolites that cause the antioxidant activity of the
strain CF-223709, which include the well-known active compounds fulvic acid
(IC50=21.58 μg/ml, DPPH assay) and vinaxanthone (IC50=35.08 μg/ml, DPPH assay),
as well as one new natural product with the chemical formula C13H12O6
(IC50=18.99 μg/ml, DPPH assay).
• two bioactive metabolites that contribute to the skin-whitening
activity of the strain CA-129531: trichostatin A and trichostatic acid.
It is anticipated that following the same extraction and fractionation protocol
to other active strains we can identify more potent candidates for industrial
development. This can serve as a proof of concept that microbial ingredients
can have successful applications in cosmeceutical industry.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
