Η παρούσα μελέτη διεξήχθη στα πλαίσια του ευρωπαϊκού προγράμματος “MICROSMETICS”, στόχος του οποίου ήταν η ανακάλυψη και η αξιοποίηση στον τομέα των καλλυντικών, καινοτόμων προϊόντων που προέρχονται από τη παγκόσμια βιοποικιλότητα, χρησιμοποιώντας σύγχρονες τεχνολογίες στους τομείς της βιοτεχνολογίας, της χημείας των φυσικών προϊόντων και της εφαρμοσμένης μικροβιολογίας.
Το συγκεκριμένο ερευνητικό πρόγραμμα περιλαμβάνει την ανακάλυψη νέων φυσικών προϊόντων προερχόμενων από την παγκόσμια μικροβιακή βιοποικιλότητα. Ήδη υπάρχουσες συλλογές καλλιεργειών μυκήτων και ακτινομυκήτων αξιοποιήθηκαν, ενσωματώνοντας σύγχρονες πλατφόρμες (in silico και in vitro) για την ορθολογική και στοχευμένη επιλογή των πιο ελπιδοφόρων στελεχών. Προηγμένες αναλυτικές προσεγγίσεις και τεχνικές εφαρμόστηκαν για την επιταχυνόμενη και αποτελεσματικότερη απομόνωση και ταυτοποίηση των βιοδραστικών μεταβολιτών. Ενσωματώθηκε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δοκιμών για την αξιολόγηση της αντιγηραντικής δράσης, και πιο συγκεκριμένα της αντιοξειδωτικής, προστατευτικής και λευκαντικής δράσης. Ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε στην επιλογή και βελτιστοποίηση των τεχνολογιών καλλιέργιας των μικροοργανισμών σε πιλοτική κλίμακα, ώστε να έιναι επιτυχής η παραγωγή σε μεγάλη κλίμακα των νέων δραστικών πρώτων υλών, με σκοπό την εκμετάλλευση τους από τη βιομηχανία των καλλυντικών.
Για το σκοπό αυτό, δημιουργήθηκε ένα ακριβές λειτουργικό μοντέλο πρόβλεψης για όλες τις γνωστές καλλυντικές λειτουργίες. Επιπροσθέτως, κατασκευάστηκαν ομόλογα μοντέλα ειδικών υποδοχέων-στόχων (τυροσινάση, ελαστάση, υαλουρονιδάση και κολλαγενάση) για τις οποίες έχουν ήδη αναπτυχθεί in vitro δοκιμές. Πάνω από 40,000 μικροβιακοί μεταβολίτες δοκιμάστηκαν in silico. Συνδυάζοντας όλα τα αποτελέσματα με το λειτουργικό μοντέλο πρόβλεψης, επιλέχθηκαν 110 μικροοργανισμοί, που ενδεχομένως έχουν την δυνατότητα να παράγουν τους εν λόγω μεταβολίτες ή ανάλογα αυτών.
Ανάμεσα στους 110 μικροοργανισμούς, περιλαμβάνονται 54 μύκητες και 56 ακτινομύκητες που προέρχονται από τη παγκόσμια μικροβιακή βιοποικιλότητα (συμπεριλαμβανομένων στελεχών από Αλάσκα, Ισπανία, Νέα Καληδονία, Χαβάη, Νότια Αφρική κλπ.). Αυτά τα στελέχη καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικά καλλιεργητικά μέσα με σκοπό το κάθε στελεχος να παράγει δέκα διαφορετικά εκχυλίσματα και με αυτόν τον τρόπο να παραχθεί πληθώρα δευτερογενών μεταβολιτών. Συνολικά παρήχθησαν 1082 εκχυλίσματα (614 εκχυλίσματα ακτινομυκήτων και 425 εκχυλίσματα μυκήτων), τα οποία τοποθετήθηκαν σε 96-τρυπες πλάκες, ώστε να ακολουθηθεί το “high throughput screening”.
Πραγματοποιήθηκε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δοκιμών για την αξιολόγηση της αντιγήραντικής, αντιοξειδωτικής, προστατευτικής και λευκαντικής δράσης όλων των παραγόμενων παρασκευασμάτων. Για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης των 1082 εκχυλισμάτων, πραγματοποιήθηκαν οι δοκιμές DPPH και ABTS. Η προστατευτική δράση στο δέρμα μελετήθηκε μετρώντας φασματοφωτομετρικά τις ανασταλτικές ιδιότητες των δειγμάτων έναντι των ενζύμων ελαστάση, κολλαγενάση και πρωτεάση. Η λευκαντική δράση αξιολογήθηκε βάσει της ικανότητας αναστολής του ενζύμου της τυροσινάσης, χρησιμοποιώντας την L-DOPA ως υπόστρωμα. Τέλος, για λόγους ασφάλειας, μελετήθηκε η κυτταροτοξικότητα των εκχυλισμάτων στις κυτταρικές σειρές A2058 (κύτταρα ανθρώπινου μελανώματος) και HepG2 (ανθρώπινα ηπατικά κύτταρα καρκινώματος) με την μέθοδο MTT. Τα αποτελέσματα των παραπάνω βιοδοκιμών επέτρεψαν την τελική διαλογή των δραστικών και μη τοξικών εκχυλισμάτων.
Σε επόμενο στάδιο της μελέτης, επιλέχθηκαν τα 20 πιο δραστικά στελέχη (19 στελέχη καλλιεργούμενα με 14 διαφορετικά καλλιεργητικά μέσα) μέσω της αξιολόγησης του χημικού προφίλ των 104 εκχυλισμάτων χρησιμοποιώντας μία στρατηγική που συνδυάζει UHPLC και LC-HRMS, σε θετικό και αρνητικό ιονισμό, με στατιστικές μεθόδους πολλών μεταβλητών. Ανάμεσα σε αυτά βρίσκονταν 8 στελέχη μυκήτων και 12 στελέχη ακτινομύκητων, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε μεγάλη κλιμακα (1L) με το βέλτιστο καλλιεργητικό μέσο. Από τα 12 στελέχη ακτινομυκήτων, τα 8 ανήκαν στο γένος Streptomyces. Το προφίλ των περιεχόμενων δευτερογενών μεταβολιτών μελετήθηκε με τη βοήθεια TLC, UPLC και LC-HRMS.
Πραγματοποιηθείσα εργασία στα πλαίσια του μεταπτυχιακού διπλώματος ειδίκευσης
Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, από τους 8 στρεπτομύκητες, οι 4 εμφάνισαν αντιοξειδωτική δράση, ενώ 2 από αυτούς εμφάνισαν δράση και στο 26S πρωτεάσωμα. Αυτά τα δύο στελέχη, τα οποία ήταν το Streptomyces spinoverrucosus (CA-218259) και το Streptomyces chartreusis (CA-126581), επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη και βιοκατευθυνόμενη απομόνωση των δευτερογενών τους μεταβολιτών, λόγω της αντιγηραντικής τους δράσης.
Τα εκχύλισματα Xad4-EtOH και EtOH του Streptomyces spinoverrucosus (CA-218259), καθώς και το υδραλκοολικό εκχύλισμα επεξεργασμένο με Xad4-EtOH του Streptomyces chartreusis (CA-126581) κατέδειξαν αξιόλογη αντιοξειδωτική δράση (31.36% ± 0.26 και 26,21% ¬± 0,22 ποσοστό δέσμευσης της ελεύθερης ρίζας DPPH στα 200 μg/ml αντίστοιχα, για τον CA-218259 και 43.69% ± 1.42 για τον CA-126581). Λόγω παρόμοιου ποσοστού αναστολής της ελεύθερης ρίζας DPPH μεταξύ των εκχυλισμάτων Xad4-EtOH και EtOH του CA-218259, πιο πλούσιου χημικού προφίλ του εκχυλίσματος EtOH, καθώς και λόγω μεγαλύτερης ανάκτησης βιομάζας στην απευθείας εκχύλιση με EtOH, επιλέχθηκε το εκχύλισμα EtOH για την βιοκατευθυνόμενη απομόνωση των δευτερογενών μεταβολιτών που περιέχει και στους οποίους οφείλεται η συγκεκριμένη δράση για τον Streptomyces spinoverrucosus, ενώ για τον Streptomyces chartreusis επιλέχθηκε το εκχύλισμα Xad4-EtOH. Παράλληλα, τα εκχύλισματα Xad4-EtOH του CA-126581 και EtOH του CA-218259 κατέδειξαν και αξιόλογη λευκαντική δράση (53.81% ± 0.48 και 30.59 ± 7.20 αναστολή του ενζύμου της τυροσινάσης στα 300 μg/ml, αντίστοιχα). Τέλος, κατά τον βιολογικό έλεγχο σε κυτταρικές σειρές των επιλεχθέντων εκχυλισμάτων των ακτινομυκήτων που αναφέρθηκαν, το αιθανολικό εκχύλισμα του Streptomyces spinoverrucosus εμφάνισε ενεργοποίηση της δραστηριότητας του 26S πρωτεασώματος, ενώ το εκχύλισμα Xad4-EtOH του Streptomyces chartreusis εμφάνισε αναστολή του.
Η ανάλυση και κλασμάτωση των εκχυλισμάτων αυτών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ταυτόχρονα κλασικές χρωματογραφικές μεθόδους (ημι-παρασκευαστική HPLC, παρασκευαστική TLC), καθώς και πιο καινοτόμες τεχνικές, όπως FCPC. Όλα τα παραγόμενα κλάσματα μελετήθηκαν ως προς την αντιοξειδωτική τους δράση, καθώς και για τη δράση τους στο πρωτεάσωμα και τα πιο δραστικα από αυτά επιλέχθηκαν για περαιτέρω κλασμάτωση είτε για ταυτοποίηση της δομής των μεταβολιτών που περιείχαν. Το σύνολο των φασματοσκοπικών δεδομένων (LC-HRMS και 1D & 2D NMR) καταγράφηκε για όλες τις απομονωμένες ενώσεις. Αποτέλεσμα όλων αυτών ήταν η βιοκατευθυνόμενη απομόνωση και ταυτοποιήση των κάτωθι:
• Πέντε μεταβολιτών του στελέχους CA-218259, οι οποίοι περιλαμβάνουν τις γνωστές ενώσεις (Ε)-ουροκανικό οξύ, Κυκλο-[Γλυκυλ-Προλίνη], Κυκλο-[Γλυκυλ-Αλανίνη], 4-μεθυλαμινοβενζοϊκό οξύ, καθώς και την L-τρυπτοφάνη, η οποία επιβεβαιώθηκε ότι αποτελεί συστατικό του θρεπτικού υλικού. Το (Ε)-ουροκανικό οξύ αποδείχθηκε ότι στη βιοδοκιμή σε κυτταρικές σειρές ενεργοποιεί τη δράση του 26S πρωτεασώματος.
• Εννέα μεταβολιτών του στελέχους CA-126581, οι οποίοι περιλαμβάνουν τις γνωστές ενώσεις νοκαρδαμίνη, δεφεροξαμίνη, φουταλοσίνη, δεοξυνοκαρδαμίνη, θυμιδίνη, 2’-δεοξυουριδίνη, 2’-δεοξυαδενοσίνη, 2’-δεοξυγουανοσίνη και 2’-δεοξυϊνοσίνη. Για το συγκεκριμένο στέλεχος, πραγματοποιήθηκε πρώτα μια κλασμάτωση με FCPC μικρής κλίμακας (στήλη όγκου: 50mL) και 6 αντιπροσωπευτικά κλάσματα στάλθηκαν για βιοδοκιμές σε κυτταρικές σειρές, καταδεικνύοντας ένα δραστικό κλάσμα εξ’αυτών. Κατόπιν πραγματοποιήθηκε μια κλασμάτωση σε μεγαλύτερη κλίμακα με FCPC (στήλη όγκου: 1000mL), από την οποία και απομονώθηκαν οι μεταβολίτες που αναφέρθηκαν. Με σύγκριση των φασμάτων HRMS σε θετικό και αρνητικό ηλεκτροψεκασμό ανάμεσα στο δραστικό κλάσμα της FCPC μικρής κλίμακας και των απομονωμένων μεταβολιτών, εικάζεται ότι ο μεταβολίτης στον οποίο οφείλεται η αναστολή του 26S πρωτεασώματος είναι η δεοξυνοκαρδαμίνη.
Αναμένεται ότι ακολουθώντας τα καλύτερα πρωτόκολλα εκχύλισης για το κάθε επιλεγμένο στέλεχος και παρόμοιες μεθόδους κλασμάτωσης, θα γίνει εφικτή η ανακάλυψη περισσότερων ικανών υποψηφίων που θα αξιοποιηθούν σε βιομηχανικό επίπεδο. Η συγκεκριμένη μελέτη αποτελεί μία δυνατή απόδειξη ότι η παγκόσμια μικροβιακή ποικιλότητα και οι μεταβολίτες που παράγει μπορούν να έχουν επιτυχημένες εφαρμογές στην παγκόσμια βιομηχανία καλλυντικών.
(EL)
The present study was carried out towards an EU funded project, named “MICROSMETICS”. The aim of MICROSMETICS project was to discover and carry to the stage of development innovative products in the area of cosmeceuticals originating from global biodiversity using emerging and state of the art technologies in the field of biotechnology, natural products chemistry and applied microbiology.
More specifically, MICROSMETICS scientific concept involved the discovery of novel natural products originating from global microbial biodiversity. Already existing culture collections of fungi and actinomycetes were exploited incorporating modern high throughput platforms (in silico & in vitro) for the rational and targeted selection of the most promising strains. Advanced analytical approaches and techniques were applied for the efficient, accelerated and advantageous isolation and identification of natural constituents as well as the quality assessment of the lead products. A broad spectrum of bioassays was incorporated for the evaluation of anti-ageing, more specifically anti-oxidant, skin-protecting, and skin-whitening activity of all derived products. Attention was given to the selection and optimization of fermentation technologies used at pilot scale for the production of new active raw materials to be used in the cosmetic industry.
In order to achieve those goals, as a first step a Rational Drug Design approach has been developed. Starting from the CosIng Repository of the European Commission, an accurate functional prediction model was created for all known cosmetic functions. Additionally it was constructed the homology models of specific cosmetic target receptors (tyrosinase, elastase, hyaluronidase and collagenase) for which the appropriate in vitro tests have already been developed. More than 40.000 known microbial metabolites were processed through a consensus scoring prediction protocol using: a) functional prediction model b) virtual screening procedure for the above 4 selected receptors c) similarity search based on all known molecules from literature that bind to the specific receptors and d) toxicological profile filtering. Combining all the results with functional prediction model and toxicological profile filtering, 110 microorgnanisms were selected that can produce those metabolites or analogues.
Among them 54 fungi and 56 actinomycetes from the global biodiversity (including strains from Antarctica, Alaska, Spain, New Caledonia, Hawaii, South Africa, Comoros Island etc.) were cultivated under “nutritional arrays” (different culture conditions) in order each single strain to produce ten different extracts and thus exploit all the potential chemodiversity that microorganisms can produce. In total 1082 sample extracts (614 actinomycetous extracts & 425 fungal extracts) have been generated, then were filtered and prepared in 96 barcoded well format and were forwared to high throughput screening.
Initially for the safety of those extracts cytotoxicity was evaluated on A2058 and HepG2 cell lines by the MTT method. The results of the above bioassays permitted the elimination of all toxic and non active extracts.
In order to select the 20 most active extracts (19 strains under 14 different fermentation media), a strategy combining UHPLC/Orbitrap-HRMS, in positive and negative modes, with multivariate statistical methods was applied. Thus, through analysis these 20 most promising extracts have been forwarded for large-scale cultivation (1L). In total, 8 fungal and 12 actinomycetous extracts were selected for further investigation. The chemical profile of those extracts was examined by using TLC, UPLC and LC-HRMS.
Work perfomed during the current master thesis
In the context of this work, among the 12 selected actinomycetes, the strains Streptomyces spinoverrucosus (CA-218259) and Streptomyces chartreusis (CA-126581) were selected for further study and for the bioguided isolation of their secondary metabolites. These 2 strains were chosen for their antioxidant / anti-ageing activity.
The hydralcoholic extract treated with Xad4-EtOH and the EtOH extracts of Streptomyces spinoverrucosus (strain CA-218259), as well as the Xad4-EtOH extract of Streptomyces chartreusis (strain CA-126584) have shown remarkable antioxidant activity (31.36% ± 0.26 and 26,21% ¬± 0,22 free radicals scavenging-DPPH assay respectively, for the strain CA-218259, and 43.69% ± 1.42 for the strain CA-126581). Due to similar free radical DPPH scavenging rate between the Xad4-EtOH and EtOH extracts of the strain Streptomyces spinoverrucosus, enriched chemical profile of the EtOH extract and due to greater biomass recovery at the direct extraction with EtOH, the EtOH extract was selected for the isolation of its bioactive metabolites and the elucidation of their structures. The EtOH extract of CA-218259 showed also remarkable skin-whitening activity (30.59% ± 7.20 inhibition of the tyrosinase enzyme). For the strain Streptomyces chartreusis, the Xad4-EtOH extract was selected, which also showed remarkable inhibition of the tyrosinase enzyme (53.81% ± 0.48). In cell-based assays, the EtOH extract of the strain Streptomyces spinoverrucosus showed activation of the 26S proteasome activity, while the Xad4-EtOH extract of the strain Streptomyces chartreusis showed its inhibition.
The profiling and the fractionation of those extracts were performed using both classical chromatographic methods (semi-prep HPLC, preparative TLC), as well as more innovative techniques, like FCPC. All the fractions were evaluated for their antioxidant activity, as well as for their activity in the 26S proteasome, and the most active ones were chosen for further fractionation or for the direct elucidation of the structure of the metabolites they contained. The full set of spectroscopic data (LC-HRMS and 1D & 2D NMR) was recorded for all isolated compounds. During the process of the bio-guided isolation we managed to isolate and identify:
• Five metabolites of the strain CA-218259, which include the well-known compounds (E)-urocanic acid, Cyclo-[Glycyl-Prolyl], Cyclo-[Glycyl-Alanyl], 4-Methylaminobenzoic acid, as well as the L-Tryptophan (which was confirmed as a component of the fermentation media). In the cell-based assays, the (E)-urocanic acid was proved to activate the 26S proteasome activity.
• Nine metabolites of the strain CA-126581, which include the well-known compounds nocardamine, deferoxamine, futalosine, deoxynocardamine, thymidine, 2’-deoxyuridine, 2’-deoxyadenosine, 2’-deoxyguanosine and 2’-deoxyinosine. For this strain, a small scale fractionation was performed, using FCPC (Column volume: 50mL) and 6 represantative fractions were forwarded for cell-based assays, proving one of them as active. Subsequently, a large scale fractionation was performed, using also FCPC (Column volume: 1000mL), isolating the nine compounds reported. By comparing the HR-MS spectras in positive and negative modes, of the active fraction (small scale FCPC) and of the isolated compounds (large scale FCPC), we assumed that deoxynocardamine is the bioactive compound.
It is anticipated that following the same extraction and fractionation protocol to other active strains we can identify more potent candidates for industrial development. This can serve as a proof of concept that microbial ingredients can have successful applications in cosmeceutical industry.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
