To φυτό Silybum marianum ανήκει στην οικογένεια Asteraceae ή Compositae. Είναι ένα άγριο λουλούδι γνωστό από την αρχαιότητα και τη παραδοσιακή λαϊκή ιατρική για τη θεραπεία ηπατικών ασθενειών. Θεωρείται προστατευτικό ενάντια ενός αριθμού ασθενειών που σχετίζονται με το ήπαρ όπως, κίρρωση, ηπατίτιδα καθώς και στην ηπατοτοξικότητα από συσσώρευση φαρμάκων. Εχει αντιφλεγμονώδη, αντιοξειδωτική, καρδιοπροστατευτική, αντικαρκινική και χημειοπροστατευτική δράση. Στα πλαίσια της παρούσας μεταπτυχιακής ερευνητικής εργασίας αναπτύχθηκε για πρώτη φορά μια μέθοδος διαχωρισμού και απομόνωσης του συμπλέγματος των μορίων της σιλυμαρίνης από υποπροϊόν του φυτού Silybum marianum (L.) Gaertn με τη χρήση χρωματογραφίας υπερκρίσιμων ρευστών (SFC). H υπερκρίσιμη ρευστή χρωματογραφία βρίσκει εφαρμογή στον διαχωρισμό φυσικών προϊόντων καθώς αποτελεί γρήγορη και αποτελεσματική τεχνική ανάλυσης σε ένα ευρύ φάσμα μορίων, ενώ η χρήση του CO2 ως κινητή φάση την καθιστά φιλική προς το περιβάλλον.
Το σύμπλεγμα της σιλυμαρίνης είναι ένα πολύπλοκο μείγμα διαφόρων πολικών ενώσεων το οποίο αποτελείται κυρίως από τα μόρια ταξιφολίνη, σιλυβίνη Α και Β, ισοσιλυβίνη Α και Β, σιλυχριστίνη Α, σιλυδιανίνη και σε μικρότερο ποσοστό από σιλυχριστίνη Β και ισοσιλυχριστίνη. Τα μόρια ανήκουν στην κατηγορία των φλαβονολιγνανίων εκτός της ταξιφολίνης που είναι φλαβονόλη. Οι φλαβονολιγνάνες είναι μια κατηγορία δευτερογενών μεταβολιτών που ανήκουν στα φλαβονοειδή και είναι γνωστές για πολλές βιολογικές ιδιότητες κυρίως όμως έχουν μελετηθεί για την ηπατοπροστατευτική τους δράση. Οι φλαβονολιγνάνες του S. marianum έχουν απομονωθεί κυρίως με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC).
Pellet του φυτού, που προήλθε από βιομηχανία επεξεργασίας σπερμάτων για την εξαγωγή του ελαίου του, χρησιμοποιήθηκε για την εκπόνηση της εργασίας. Στη φυτοχημική ανάλυση, το δείγμα αρχικά προχώρησε σε διαδοχικές εκχυλίσεις σε υπερήχους, ύστερα για την κλασμάτωση χρησιμοποιήθηκε Χρωματογραφία Κατανομής με Φυγοκέντρηση (FCPC) και για την απομόνωση των καθαρών μορίων υποβλήθηκε σε Χρωματογραφία Υπερκρίσιμων Ρευστών (SFC). Από τη διαδικασία του CPC εξετάστηκαν κλάσματα για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής τους δράσης. Για τον έλεγχο της αντιοξειδωτικής ικανότητας πραγματοποιήθηκαν βιολογικές δοκιμές με τη μέθοδο του διφαινυλοπικρυλυδραζυλίου-DPPH. Επίσης βιολογικές δοκιμές έγιναν για τον έλεγχο της λευκαντικής δράσης, όπου αξιολογήθηκε βάσει της ικανότητας αναστολής του ενζύμου της τυροσινάσης, χρησιμοποιώντας την L-DOPA ως υπόστρωμα καθώς και δοκιμές πραγματοποιήθηκαν για την αντιβακτηριακή δράση του μεθανολικού εκχυλίσματος με τη μέθοδο Διάχυσης Βιοενεργούς ουσίας σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα.
Τελικά απομονώθηκαν τα μόρια ταξιφολίνη, σιλυχριστίνη, ισοσιλυβίνη Α, ισοσιλυβίνη Β, σιλυδιανίνη, μείγμα σιλυβίνης Α & Β, διυδροδικωνιφεροαλκοόλη και μόριο 1-N-φερυλαμινοβουτυλο-4-π-υδροξυβενζαμίδη. Η ταυτοποιήση των μορίων έγινε με τη βοήθεια συγκριτικής Χρωματογραφίας Υπερυψηλής Απόδοσης (uHPLC), με φασματομετρίας μάζας (MS) και φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (1 & 2D NMR). Τα καθαρά μόρια υποβλήθηκαν σε βιολογικές δοκιμές για τη λευκαντική και την αντιοξειδωτική τους δράση.
(EL)
Silybum marianum belongs to the family Asteraceae or Compositae. It is a wild flower known for the treatment of a broad spectrum of liver maladies since the ancient times from the traditional folk medicine. It is considered protective against a number of diseases associated with the liver, for example, toxicity of medicines, cirrhosis and hepatitis. It has anti-inflammatory, antioxidant, cardioprotective, anti-cancer and chemoprotective biological properties. During this postgraduate research work, a method of separation and isolation of the silymarin complex deriving from the methanolic extract of Silybum marianum by-products was developed for the first time, utilizing supercritical fluid chromatography (SFC).
Supercritical fluid chromatography has been established as a separation method in natural products chemistry. SFC is a fast and effective analytical technique for the isolation of a wide range of secondary metabolites, while the use of CO2 as a mobile phase makes it environmentally friendly. The silymarin complex is a mixture of various polar compounds which consists mainly of the molecules taxifolin, silybin A and B, isosilybin A and B, silychristin A silydianin and, to a lesser extent, from silychristin B and isosilychristin. These molecules belong to the category of flavonolignans with the exception of taxifolin which is flavonol. The flavonolignans is a category of secondary metabolites in flavonoids and they are known for possessing many biological properties but they are studied especially for the hepatoprotective action. So far, the flavonolignans found in S. marianum have been isolated mainly by high performance liquid chromatography (HPLC).
The pelletized material, which came from the residues of the oil-processing industry of the fruits of S. marianum, was used for the preparation of the work. During the phyto-chemical analysis, the sample initially was extracted successively by employing ultrasound extraction methodology and methanol as the extraction solvent. Moreover, for the fractionation of the methanolic extract Centrifugal Partition Chromatography (FCPC) was used, while for the separation and isolation of the secondary metabolites, the supercritical fluid chromatography (SFC) was applied. Molecules isolated from the aforementioned procedure are taxifolin, silydianin, silychristin, isosilybin A, isosilybin B, a mixture of silybin A and B, as well as 1-N-feruloylaminobutyl-4-ρ-hydroxybenzamide and dehydrodiconiferyl alcohol. The fractions from the CPC process were examined for their antioxidant and skin whitening properties. To test the antioxidant capacity biological tests were conducted using DPPH assay and concerning the whitening activity, biological tests were conducted in order to evaluate the inhibition of the enzyme tyrosinase, using L-DOPA as a substrate. Finally, the structure of the isolated compounds was elucidated by 1D and 2D NMR spectroscopy and mass spectrometry (LC-HRMS/MS).
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
