Κατά τη διαδικασία ανακάλυψης φαρμάκων, πολύ κρίσιμο στάδιο θεωρείται η εύρεση μικρών βιοδραστικών μορίων προσδεμάτων (ligands) που εμφανίζουν υψηλή συγγένεια πρόσδεσης με μακρομοριακούς στόχους (π.χ. πρωτεΐνες). Η εύρεση όμως μικρών μορίων με ασθενείς αλληλεπιδράσεις είναι κρίσιμη για τις καινοτόμες ανακαλύψεις. Τα φάρμακα ανακαλύπτονται μέσα από πειράματα διαλογής αρκετών χιλιάδων έως και εκατομμυρίων χημικών ουσιών που δοκιμάζονται μία προς μία για το αν επιφέρουν το επιθυμητό αποτέλεσμα για τη δράση τους σε συγκεκριμένο στόχο. Οι μέθοδοι διαλογής HTS (high-throughput screening) είναι βιοχημικές, βιοφυσικές και άλλες κυτταρικού επιπέδου κι έχουν αναπτυχθεί με τέτοιο τρόπο ώστε να γίνονται γρήγορα οι αξιολογήσεις αλλά και αποτελεσματικά σε εκατομμύρια μόρια. Επίσης, οι υπολογιστές επιταχύνουν τη διαδικασία και μειώνουν και το κόστος. Στις μέρες μας η ανακάλυψη καινοτόμων φαρμάκων επιτελείται με ορθολογικό τρόπο. Αρχικά, ταυτοποιείται το μακρομόριο στόχος και στη συνέχεια με διάφορες αξιόπιστες πειραματικές διαδικασίες μετράται η βιοδραστικότητα μιας σειράς χημικών ενώσεων hits (οδηγοί-δομής) έναντι ενός στόχου. Αυτές οι διαδικασίες μπορεί να είναι και βιοφυσικές μέθοδοι, όπως η κρυσταλλογραφία, η φασματοσκοπία NMR κ.ά. Τις τελευταίες πέντε δεκαετίες, οι τεχνικές NMR ligand-based screening δίνοντας σημαντικές πληροφορίες κατά το στάδιο ταυτοποίησης και ελέγχου των βιοδραστικών αυτών ουσιών και ειδικά χρησιμοποιώντας την τεχνική STD-NMR η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στη διαλογή και επιβεβαίωση αυτών των ενώσεων, προσφέρουν σημαντική βοήθεια στην κλασσική μέθοδο διαλογής HTS, ώστε να εντοπιστούν βιοδραστικά μόρια hits καθώς και να βρεθούν από αυτά τα μόρια hits, ένα ή περισσότερα μόρια ενώσεις-οδηγοί (leads). Όσο περισσότερο κατανοηθεί η αλληλεπίδραση μικρού μορίου και πρωτεΐνης (στόχου), τόσο πιο ορθολογικός θα είναι ο σχεδιασμός και τα νέα φαρμακευτικά μόρια θα είναι καλύτερα.
Η φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού NMR (Nuclear Magnetic Resonance), αναφέρεται ως “gold standard” [1] μέθοδος σχεδιασμού φαρμάκων FBDD (Fragment Based Drug Design), όσο και άλλων μεθόδων. Ο ορισμός αυτός προέκυψε γιατί από τη δεκαετία του 1970 έως σήμερα, αποτελεί μια εξαιρετική μέθοδο άμεσης αναγνώρισης μικρών μορίων (ligands <500Da) που αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες (μακρομόρια στόχοι ή υποδοχείς >5000Da), καθώς και μία εξαιρετική μέθοδο αποσαφήνισης της δομικής διαμόρφωσης. Η συστηματική διερεύνηση μικρών μορίων ή “μικρών” χημικών ομάδων, είναι εξαιρετικά σημαντική για το σχεδιασμό φαρμακευτικών ουσιών με βελτιωμένη και αυξημένη δραστικότητα. Ως πειραματική διαδικασία διερεύνησης προτιμάται η φασματοσκοπία NMR κι αυτό οφείλεται στην απλότητα, στην ταχύτητα και στην επαναληψιμότητά της εφόσον το ίδιο δείγμα μπορεί να αναλυθεί επανειλημμένα. Επίσης, αποτελεί ένα ενεργό και διαρκώς αναπτυσσόμενο πεδίο έρευνας.
Για όλους τους προαναφερθέντες λόγους εγκαταστήθηκε και επικυρώθηκε η τεχνική STD-NMR και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν πειράματα βασιζόμενα στα πλεονεκτήματα αυτής της τεχνικής, ώστε να εκτιμηθεί η αλληλεπίδραση μικρών μορίων (ligands) με γνωστές πρωτεΐνες. Επίσης, πραγματοποιήθηκαν και διάφοροι υπολογισμοί μέσω προσομοιώσεων σε υπολογιστή, ώστε να κατανοηθούν διάφορες φυσικοχημικές παράμετροι.
Οι πρωτεΐνες, που μελετήθηκαν υπήρχαν στο εργαστήριο και γι αυτές είχαν γίνει προηγούμενες μελέτες και υπήρχαν και κάποια συνθετικά μόρια προς επικύρωση. Ουσιαστικά, σε αυτήν την εργασία γίνεται η επικύρωση σε δοκιμαστικό σωλήνα, για κάτι το οποίο είχε βρεθεί ως υποψία σε κυτταρικές σειρές. Τα μόρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν είτε αμινοξέα, είτε προέρχονταν από εργαστηριακή σύνθεση, είτε προέρχονταν από εκχυλίσματα φυσικών προϊόντων. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν δύο αμινοξέα, εννέα συνθετικά μόρια, καθώς και δύο μικρά μόρια με αντιοξειδωτικές ιδιότητες που περιέχονται στο εκχύλισμα πράσινου τσαγιού, καθώς και στη φλούδα του πορτοκαλιού. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε: (α) με την πιο κοινή και άμεση μονοδιάστατη μέθοδο 1D 1H-NMR, γιατί παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία, αλλά και γιατί υπάρχει πληθώρα ατόμων υδρογόνου στα περισσότερα μόρια, (β) με διδιάστατες μεθόδους (κυρίως 2D COSY) που βοηθούν στον εντοπισμό των ατόμων που συνδέονται μεταξύ τους, (γ) με το χρόνο εγκάρσιας σπιν-σπιν αποδιέγερσης T2, γιατί εκμεταλλευόμαστε τις εγγενείς ατομικές ιδιότητες και (δ) με τη μέθοδο STD-NMR που αποτελεί state-of-the-art μέθοδο NMR Ligand-based screening και η οποία βασίζεται στο φαινόμενο NOE, εξασφαλίζοντας με αυτόν τον τρόπο μεγαλύτερη ευαισθησία λόγω της διπολικής σύζευξης των μορίων στο χώρο.
Για να εγκατασταθεί η μέθοδος STD-NMR, πραγματοποιήθηκε η εφαρμογής της σε γνωστά συστήματα αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-ligand (π.χ. αλβουμίνη-τρυπτοφάνη) όπως έχουν περιγραφεί στη βιβλιογραφία, ώστε να γίνει επικύρωση της μεθόδου για εμάς. Ακόμα, έγινε προσπάθεια βελτιστοποίησης της μεθόδου για εξάλειψη τυχόν artefacts. Στη συνέχεια, ελέγχεται η διαλυτότητα των συνθετικών μορίων σε οργανικούς διαλύτες (MeOH και Ακετονιτρίλιο), καθώς και σε δισαπεσταγμένο νερό ddH2O, επειδή κατά την εφαρμογή της μεθόδου STD-NMR ένας συνηθισμένος περιορισμός είναι η μη διαλυτοποίηση των μικρών μορίων (ligands) σε υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα (buffers). Κατόπιν, συνεχίστηκαν αυτά τα πειράματα με τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες που υπήρχαν στο εργαστήριο. Πιο συγκεκριμένα: (α) εκτιμήθηκε η αλληλεπίδραση του C-τελικού άκρου της πρωτεΐνης c-Myc, 85 αμινοξικών καταλοίπων, με συνθετικά μόρια τα οποία έχουν δείξει, όπως προαναφέρθηκε, δράση σε κυτταρικό επίπεδο, (β) εκτιμήθηκε η αλληλεπίδραση του ενζύμου β-συνθετάση της κυσταθειονίνης (CBS) με τα μόρια EGCG (γαλλική επιγαλλοκατεχίνη-3, C22H18O11) και ECg (επικατεχίνη γαλλικού εστέρα, C22H18O10) που περιέχονται στο εκχύλισμα πράσινου τσαγιού και στη φλούδα του πορτοκαλιού, καθώς και με το συνθετικό μόριο 1 που είναι παράγωγο της πυραζολοπυριδίνης (πυραζολο[3,4-c]πυριδίνη), ώστε να βρεθούν ισχυροί και επιλεκτικοί αναστολείς στο εσωτερικό του ενεργού κέντρου του (αποτελεί την κυρίαρχη γεωμετρία πρόσδεσης του μορίου 1, όπως προσδιορίζεται από τον αλγόριθμο επαγόμενης προσαρμογής για πρόσδεση [2]), εφόσον ως τώρα ο κυρίαρχος αναστολέας του ΑΟΑΑ (αμινοοξυοξικό οξύ) έχει μη επιλεκτική πρόσδεση (non selective, non-specific binding) με το ένζυμο, και δεν έχει επικυρωθεί ακόμα αν το CBS είναι ένας φαρμακολογικός στόχος ενδιαφέροντος.
Τελικά, βάση των αποτελεσμάτων από τα φάσματα διαλογής NMR του ενζύμου CBS με τα μικρά μόρια, γίνεται περαιτέρω έλεγχος με σύγχρονες μεθόδους ορθολογικού σχεδιασμού SBDD (Structure Based Drug Design) ώστε να κατανοηθούν περαιτέρω διάφορες φυσικοχημικές παράμετροι του συστήματος CBS/ EGCG. Επιλέχτηκε η τρισδιάστατη δομή του ενζύμου CBS που είναι διαθέσιμη στο δημόσιο πρωτεϊνικό αποθετήριο Protein Data Bank (PDB), χωρίς συγκρυσταλλωμένο ligand στην κρυσταλλογραφική δομή του (Protein Data Bank ID code: 1jbq). Τρεις μέθοδοι SBDD χρησιμοποιήθηκαν: οι χαρακτηριστικές υπολογιστικές μέθοδοι (α) μοριακής πρόσδεσης CBS-EGCG και (β) προσομοίωση μοριακής δυναμικής, καθώς και (γ) μία νέα προσέγγιση, η μεταδυναμική προσομοίωση στην οποία γίνεται αποτελεσματική δειγματοληψία του διαμορφωτικού χώρου.
Η διεξαγωγή των πειραμάτων 1D, 2D και STD NMR έγινε κυρίως σε φασματόμετρο Bruker Avance 400Hz, καθώς και σε φασματόμετρο Bruker Avance 600Hz. Η μοριακή πρόσδεση και οι προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό Schrödinger Maestro 2021, ενώ η προσομοίωση μεταδυναμικής πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό Schrödinger Desmond 2021.
Το Marvin Sketch χρησιμοποιήθηκε για τη σχεδίαση και την εμφάνιση των χημικών ενώσεων, καθώς και για την HNMR πρόβλεψη των φασματικών κορυφών των υποψήφιων ligands, Marvin Sketch v. 21.18.0, 2021, ChemAxon (http:// www.chemaxon.com).
(EL)
In the drug discovery process, finding small bioactive ligands that have high binding affinity to macromolecular targets (e.g. proteins) is considered a very critical step. The finding of small molecules with weak interactions is critical for innovative discoveries. Drugs are discovered through screening experiments of several thousand to millions of chemicals that are tested one by one to see if they bring about the desired effect for their action on a particular target. HTS (high-throughput screening) methods are biochemical, biophysical and other cellular-level screening methods and have been developed in such a way that evaluations are both rapid and efficient on millions of molecules. Computers also speed up the process and reduce costs. Nowadays, innovative drug discovery is carried out in a rational way. First, the target macromolecule is identified and then the bioactivity of a series of chemical hit compounds against a target is measured by various reliable experimental procedures. These procedures can be biophysical methods such as crystallography, NMR spectroscopy, etc. In the last five decades, NMR ligand-based screening techniques giving important information during the identification and screening stage of these bioactive compounds and especially using the STD-NMR technique which plays an important role in the screening and confirmation of these compounds, offer significant help to the classical HTS screening method to identify bioactive hit molecules and to find from these hits one or more lead molecules. The more the interaction of small molecule and protein (target) is understood, the more rational the design will be and the better the new drug molecules will be.
Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy is referred to as the "gold standard" [1] method of FBDD (Fragment Based Drug Design) drug design, as much as other methods. This designation arose because from the 1970s to the present day, it has been an excellent method for direct identification of small molecules (ligands <500Da) interacting with proteins (target macromolecules or receptors >5000Da), as well as an excellent method for elucidating structural conformation. The systematic investigation of small molecules, or "small" chemical groups, is extremely important for the design of pharmaceuticals with improved and enhanced activity. NMR spectroscopy is preferred as an experimental investigation procedure and this is due to its simplicity, speed and repeatability since the same sample can be analysed repeatedly. It is also an active and constantly developing field of research.
For all the above reasons, the STD-NMR technique was established and validated and then experiments based on the advantages of this technique were carried out to assess the interaction of small molecules (ligands) with known proteins. Various calculations were also carried out by means of computer simulations in order to understand various physicochemical parameters.
The proteins studied were available in the laboratory for which previous studies had been done and some synthetic molecules were available for validation. Essentially, in this work, validation is done in a test tube for something that was found to be suspected in cell lines. The molecules used were either amino acids, derived from laboratory synthesis, or derived from extracts of natural products. In particular, two amino acids, nine synthetic molecules, and two small molecules with antioxidant properties contained in green tea extract as well as in orange peel were studied. The study was carried out: (a) by the most common and direct one-dimensional 1D 1H-NMR method, because it shows high sensitivity, but also because there is an abundance of hydrogen atoms in most of the molecules, (b) by two-dimensional methods (mainly 2D COSY) that help to identify the atoms that are linked together, (c) by the T2 transverse spin-spin de-excitation time, because we exploit the intrinsic atomic properties, and (d) by the STD-NMR method which is a state-of-the-art NMR ligand-based screening method based on the NOE effect, thus ensuring higher sensitivity due to the dipole coupling of molecules in space.
In order to establish the STD-NMR method, its application to known protein-ligand interaction systems (e.g. albumin-tryptophan) as described in the literature was performed to validate the method for us. Still, an attempt was made to optimize the method to eliminate any artefacts. Next, the solubility of the synthetic molecules in organic solvents (MeOH and Acetonitrile) as well as in ddH2O was tested, because when applying the STD-NMR method a common limitation is the non-solubilization of small molecules (ligands) in aqueous buffers. Then, these experiments were continued with the specific proteins present in the laboratory. More specifically: (a) the interaction of the C-terminal end of the c-Myc protein, 85 amino acid residues, with synthetic molecules that have shown, as mentioned above, activity at the cellular level was evaluated; (b) the interaction of the cystathionine β-synthase (CBS) enzyme with EGCG (epigallocatechin-3-gallate, C22H18O11) and ECg (epicatechin gallate, C22H18O10) molecules was evaluated, contained in green tea extract and orange peel, and with the synthetic molecule 1 which is a derivative of pyrazolopyridine (pyrazolo[3, 4-c]pyridine) to find potent and selective inhibitors within its active site (it is the dominant binding geometry of molecule 1, as determined by the induced fit algorithm for binding [2]), since so far the dominant inhibitor AOAA (aminooxyacetic acid) has non-selective, non-specific binding to the enzyme CBS, and it has not yet been validated whether CBS is a pharmacological target of interest.
Finally, based on the results from the NMR screening spectra of the CBS enzyme with small molecules, further screening with modern rational SBDD (Structure Based Drug Design) methods is performed to further understand various physicochemical parameters of the CBS/ EGCG system. The three-dimensional structure of CBS enzyme available in the public Protein Data Bank (PDB) protein repository without co-crystallized ligand in its crystallographic structure (Protein Data Bank ID code: 1jbq) was chosen. Three SBDD methods were used: the typical computational methods of (a) CBS-EGCG molecular binding, (b) molecular dynamics simulation, and (c) a novel approach, metadynamic simulation in which efficient sampling of the conformational space is performed.
The 1D, 2D and STD NMR experiments were performed mainly on a Bruker Avance 400Hz spectrometer, as well as on a Bruker Avance 600Hz spectrometer. Molecular binding and molecular dynamics simulations were performed with Schrödinger Maestro 2021 software, while metadynamics simulation was performed with Schrödinger Desmond 2021 software.
Marvin Sketch was used for the design and display of chemical compounds, as well as for HNMR prediction of spectral peaks of candidate ligands, Marvin Sketch v. 21.18.0, 2021, ChemAxon (http:// www.chemaxon.com).
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
