Η τρέχουσα ερευνητική εργασία στοχεύει στην επιτυχή εκτέλεση της σύζευξης, του εγκλωβισμού και της απελευθέρωσης του αντικαρκινικού φαρμάκου οξαλιπλατίνη. Η οξαλιπλατίνη χρησιμοποιείται σήμερα κυρίως στη αντιμετώπιση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Προκειμένου να εγκλωβιστεί το φάρμακο, συντέθηκαν πολυπεπτίδια και υβριδικά συμπολυμερή, με βάση την πολυ(L-Ιστιδίνη). Τα πολυπεπτίδια συντέθηκαν μέσω της διαδικασίας πολυμερισμού διάνοιξης δακτυλίου (ROP) του αντίστοιχου προστατευμένου Ν-καρβοξυανυδρίτη (μονομερές). Χρησιμοποιήσαμε έναν μακροεκκινητή πολυ(αιθυλενοξειδίου) (mPEO-NH2) με ακραίες χαρακτηριστικές αμίνες για τα υβριδικά συμπολυμερή καθώς και εξυλαμίνη για ομοπολυπεπτίδια πολυ(L-Ιστιδίνη). Χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές υψηλού κενού για να εξασφαλιστεί η υψηλή καθαρότητα όλων των ενώσεων, η οποία είναι απαραίτητη κατά τη σύνθεση των Ν-καρβοξυ ανυδριδίων των α-αμινοξέων, καθώς και τη σύνθεση καλά καθορισμένων πολυμερών.
Η επιτυχής σύνθεση των πολυμερών επιβεβαιώθηκε με Πυρηνικό Μαγνητικό Συντονισμό πρωτονίων (1H-NMR), Φασματοσκοπία Υπέρυθρου Μετασχηματισμού Fourier (FT-IR) και Χρωματογραφία Αποκλεισμού Μεγεθών (SEC) όπου ήταν εφικτό. Η Poly(L-Ιστιδίνη) είναι ένα πεπτίδιο που φέρει την πλευρική ομάδα του ιμιδαζολίου, η οποία προσδίδει μοναδικές ιδιότητες. Είναι ένα πεπτίδιο που ανταποκρίνεται σε αλλαγές στο pH με την ικανότητα να λειτουργεί ως υποκαταστάτης για μεταλλικά ιόντα, όπως το Pt. Με βάση την προηγούμενη εργασία της Δρ. Βαρβάρας Αθανασίου, το αμφίφιλο συμπολυμερές του PEO-b-PHis είχε βασικό ρόλο στη μελέτη αυτή. Τα υβριδικά συμπολυμερή αυτοοργανώνονται σε υδατικά διαλύματα και σχηματίζουν νανοδομές που μοιάζουν με μικκύλια, καθώς σε ουδέτερο pH η πολυ(L-ιστιδίνη) είναι υδρόφοβη. Τα νανοσωματίδια αποτελούνται από ένα εξωτερικό υδρόφιλο κέλυφος αλυσίδων πολυ(αιθυλενοξειδίου) και έναν υδρόφοβο πυρήνα με βάση την πολυ(L-Ιστιδίνη). Όπως είναι ευρέως γνωστό, το pH του καρκινικού ιστού και συγκεκριμένα του περιβάλλοντος του όγκου είναι πιο όξινο από αυτό των φυσιολογικών ιστών, δηλαδή 6,5–7,2 (το pH των υγιών ιστών είναι 7,4). Ως εκ τούτου, τα πολυμερή που αποκρίνονται σε αλλαγές στο στο pH χρησιμοποιούνται ευρέως σε συστήματα χορήγησης φαρμάκων για τη στόχευση καρκινικών κυττάρων. Σε χαμηλό pH, η πολυ(L-Ιστιδίνη) πρωτονιώνεται, και κατά συνέπεια, χαλάει η δομή του μικκυλίου και το εγκλωβισμένο φάρμακο απελευθερώνεται μέσα στο καρκινικό κύτταρο.
Η ικανότητα της πολυ(L-Ιστιδίνης) να λειτουργεί ως υποκαταστάτης του φαρμάκου με βάση το Pt αξιοποιήθηκε επίσης σε προηγούμενη μελέτη. Το φάρμακο που μελετήθηκε ήταν η σισπλατίνη (Cisplatin) αλλά έχασε τη θεραπευτική του ικανότητα όταν έφτασε σε δοκιμές in vivo. Αυτό οφείλεται στη ικανότητα της σισπλατίνης να αλλάζει δομή κατά την απελευθέρωσή από το νανοσωματίδιο. Προκειμένου να παρακαμφθεί αυτό το μειονέκτημα, χρησιμοποιήθηκαν εναλλακτικά παράγωγα πλατίνας σε αυτήν την εργασία. Επιλέχθηκε η οξαλιπλατίνη (oxaliplatin) , καθώς οι χηλικοί υποκαταστάτες που φέρει διατηρούν τη στερεοχημεία του φαρμάκου, ενώ η σταθερότητά του σε υδατικά διαλύματα επιβεβαιώθηκε με φασματοσκοπία NMR σε D2O. Η συμπλοκοποίηση της πολυ(L-ιστιδίνης) και της οξαλιπλατίνης μελετήθηκε επίσης μέσω φασματοσκοπίας NMR στον πρωτονιωμένο διαλύτη 1,1,1,3,3,3-Εξαφθορο-2-προπανόλη (HFIP). Αυτός ο διαλύτης χρησιμοποιήθηκε λόγω της ικανότητάς του να είναι ένας καλός διαλύτης για την πολυ(L-Ιστιδίνη). Προκειμένου τα δείγματα να μετρηθούν σε αυτόν τον διαλύτη, η χρήση του τριχοειδούς d6-DMSO ήταν υποχρεωτική. Για να ολοκληρωθεί αυτή η μελέτη, ο εγκλωβισμός και η απελευθέρωση του φαρμάκου από τα νανοσωματίδια μελετήθηκε μέσω φασματοσκοπίας NMR σε D2O και ρυθμιστικό διάλυμα D2O(pH=5), φασματομετρία μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICPMS), θερμοβαρυμετρική ανάλυση (TGA), κυκλικός διχρωισμός (CD) και δυναμική σκέδαση φωτός (DLS).
(EL)
The current research work aims to successfully execute the conjunction, encapsulation and release of the anti-cancer drug oxaliplatin. Oxaliplatin is currently used mainly in the therapeutic treatment of colorectal cancer.
In order to encapsulate the drug, polypeptides and hybrid copolymers, were synthesized, based on poly(L-Histidine). The polypeptides were synthesized through ring-opening polymerization (ROP) process of the corresponding protected N-carboxy anhydride (monomer). We used an amine end-functionalized poly(ethylene oxide) (mPEO-NH2) macroinitiator for the hybrid copolymers as well as hexylamine for poly(L-Histidine) homopolypeptides. High-vacuum techniques were utilized to ensure the high purity of all compounds, which is essential during the synthesis of N-carboxy anhydrides of α-amino acids, as well as the synthesis of well-defined polymers. The successful synthesis of the polymers was confirmed by Size Exclusion Chromatography (SEC) when it was possible, proton Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR) and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR).
Poly(L-Histidine) is a peptide that bears an imidazole group, that gives its unique properties. It is a pH responsive peptide with the ability to work as a ligand for metal ions, such as Pt. Based on the previous work of Dr. Varvara Athanasiou the amphiphilic copolymer of the PEO-b-PHis had a key role in this study. The hybrid copolymers self-assemble in aqueous media and form micelle-like nanostructures, since at neutral pH poly(L-histidine) is hydrophobic. The nanoparticles consist of an outer hydrophilic corona of poly(ethylene oxide) chains, and a pH-responsive hydrophobic core based on poly(L-Histidine). As it is commonly known, the pH of cancer tissue, specifically the tumor environment is more acidic than that of normal tissues i.e. 6.5–7.2 (pH of healthy tissues is 7.4). Therefore, pH-responsive polymers are widely used in drug delivery systems to target cancer cells. At low pH, poly(L-Histidine) becomes protonated, and consequently, the micelles disassemble and the encapsulated drug is released within the cancerous cell. The ability of poly(L-Histidine) to function as a ligand of the Pt based drug was also exploited in this previous study. The drug Cisplatin was encapsulated in the nanoparticles but it lost its therapeutic ability when it reached in vivo trials. This was due to the unique ability of cisplatin to gain the trans formation throughout its release from the nanoparticle. In order to bypass this drawback, alternative platinum derivatives were used in this work. Oxaliplatin was chosen, since the oxalate as well as the diamino cyclohexane groups maintain the stereochemistry of the drug all over the procedures of encapsulation and release, while its stability in aqueous solutions was confirmed by NMR spectroscopy in D2O. The conplexation of poly(L-Histidine) and oxaliplatin was also studied via NMR spectroscopy in the protonated solvent 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP). This solvent was employed because of its ability to be a good solvent for poly(L-Histidine). In order for the samples to be measured in this solvent the use of d6-DMSO capillary was mandatory.
To conclude this study, the encapsulation and release of the drug in PEO-b-PHis polymers was studied via NMR spectroscopy in D2O and D2O Buffer(pH=5), Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICPMS), Thermogravimetric analysis (TGA), Circular Dichroism (CD) and Dynamic Light Scattering (DLS).
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
