Η Πολλαπλή Σκλήρυνση (ΠΣ) αποτελεί μια πολύπλευρη απομυελινωτική νόσο με έντονα αυτooάνοσα, νευροεκφυλιστικά και νευροφλεγμονώδη χαρακτηριστικά. Είναι συχνά απαντούμενη, αφού πλήττει πάνω από 2 εκατομμύρια ανθρώπους παγκοσμίως και εμφανίζεται συνηθέστερα σε νεαρές ηλικίες. Η αντιμετώπισή της στηρίζεται κατά κόρον σε θεραπείες τροποποίησης της νόσου (DMTs), στοχεύοντας κυρίως τα Β και Τ κύτταρα, που ανήκουν στο σκέλος της επίκτητης ανοσίας. Εμμέσως, όμως, οι εν λόγω χορηγούμενες θεραπείες δείχνουν να επηρεάζουν σημαντικά την αφθονία αλλά και την λειτουργία του πολυπληθέστερου πληθυσμού κυττάρων της έμφυτης ανοσίας, που είναι τα ουδετερόφιλα. Ο ρόλος των τελευταίων στην παθογένεση της ΠΣ δεν έχει αποσαφηνιστεί και λίγες έρευνες τα τελευταία χρόνια αναφέρουν την αύξησή τους στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΠΣ, μέσω του δείκτη NLR, καθώς και την παρουσία τους στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) ασθενών με παιδιατρική ΠΣ. Τα ουδετερόφιλα αποτελούν έναν αρκετά ετερογενή πληθυσμό, με ορισμένους υπο-πληθυσμούς να σχετίζονται με παθολογικές καταστάσεις, ανάμεσα στις οποίες συγκαταλέγεται και η αυτοανοσία. Παράλληλα, σε αρκετά αυτooάνοσα νοσήματα φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο και ένας από τους βασικούς μηχανισμούς δράσης των ουδετερόφιλων, που είναι η απελευθέρωση NETs, λόγω του ότι τα τελευταία είναι «διακοσμημένα» με μόρια που αποτελούν αυτοαντιγόνα. Στην παρούσα διπλωματική εργασία επιδιώχθηκε η διερεύνηση μεταβολών συγκεκριμένων υπο-πληθυσμών των ουδετερόφιλων καθώς και της παρουσίας NETs σε περιφερικό αίμα μεταξύ ασθενών με πρώτο κλινικό επεισόδιο ΠΣ, ασθενών με ΠΣ σε ύφεση και υγιών δοτών. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ένα πάνελ δεικτών στο περιφερικό αίμα των παραπάνω ομάδων για διαχωρισμό των ουδετερόφιλων και δείχθηκε ότι ο υπο-πληθυσμός των γηρασμένων ουδετερόφιλων αυξανόταν σημαντικά σε ασθενείς με πρώτο κλινικό επεισόδιο ΠΣ σε σχέση με τις άλλες δύο κατηγορίες, ενώ ο υπο-πληθυσμός των κατασταλτικού τύπου ουδετερόφιλων αυξανόταν περισσότερο στους ασθενείς με ΠΣ σε ύφεση. Για τη διερεύνηση της απελευθέρωσης ΝΕΤs απομονώθηκαν ουδετερόφιλα από ολικό περιφερικό αίμα, τα οποία σημάνθηκαν με MPO και citH3 και παρατηρήθηκε μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας ότι τα ουδετερόφιλα ασθενών με πρώτο κλινικό επεισόδιο είχαν μεγαλύτερη ικανότητα απελευθέρωσης NETs σε σχέση με τις άλλες δύο κατηγορίες. Παράλληλα, για να επιβεβαιωθεί η ποσοτικοποίηση των NETs από τη συνεστιακή μικροσκοπία, απομονώθηκαν συμπλέγματα DNA/MPO έπειτα από καλλιέργεια των απομονωμένων ουδετερόφιλων των τριών ομάδων και μετρήθηκαν μέσω ELISA. Οι μετρήσεις της οπτικής απορρόφησης έδειξαν αυξημένα ποσοστά DNA/MPO συμπλεγμάτων σε ασθενείς με πρώτο κλινικό επεισόδιο σε σχέση με τις άλλες δύο ομάδες. Τέλος, διερευνήθηκε η σχέση μεταξύ των ποσοστών απελευθέρωσης NETs και των μεταβολών των ποσοστών των υπο-πληθυσμών των ουδετερόφιλων και δείχθηκε στατιστικά σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ των ποσοστών των γηρασμένων ουδετερόφιλων και των ποσοστών των DNA/MPO συμπλεγμάτων. Συμπερασματικά, φαίνεται πως είναι πιθανή η συμμετοχή των ουδετερόφιλων σε κάποιον από τους μηχανισμούς που διέπουν την παθοφυσιολογία της ΠΣ και ενδεχομένως θα μπορούσαν να αποτελέσουν βιοδείκτη για την ενεργότητα της νόσου.
(EL)
Multiple Sclerosis is a multifaceted demyelinating disease with strong autoimmune, neurodegenerative and neuroinflammatory features. It is common since it affects more than 2 million people worldwide and occurs most commonly in young people. Its treatment is mainly based on disease-modifying therapies (DMTs), mainly targeting B and T cells, which belong to the arm of adaptive immunity. Indirectly, however, these administered treatments appear to significantly affect the abundance and function of the most numerous cell population of innate immunity, which is the neutrophils. The role of the latter in the pathogenesis of MS has not been clarified and few studies in recent years report their increase in the peripheral blood of patients with Multiple Sclerosis, through the NLR index, as well as their presence in the cerebrospinal fluid (CSF) of pediatric MS patients. Neutrophils are a fairly heterogeneous population, with certain subpopulations associated with pathological conditions, including autoimmunity. At the same time, in several autoimmune diseases, one of the basic mechanisms of action of neutrophils seems to play an important role, which is the release of NETs, due to the fact that the latter are "decorated" with molecules that are self-antigens. In this thesis, we sought to investigate changes in specific subpopulations of neutrophils as well as the presence of NETs in the peripheral blood between patients with a first clinical episode of MS, patients with MS in remission and controls. For this purpose, a panel of markers in the peripheral blood of the above groups was used to separate neutrophils and it was shown that the subpopulation of aged neutrophils increased significantly in patients with a first clinical episode of MS compared to the other two categories, while the subpopulation of suppressor neutrophils increased more in MS patients in remission. To investigate the release of NETs, neutrophils were isolated from whole peripheral blood, they were labeled with MPO and citH3, and it was observed through confocal microscopy that neutrophils from patients with a first clinical episode had a greater ability to release NETs than the other two categories. In parallel, to confirm the quantification of NETs by confocal microscopy, DNA/MPO complexes were isolated after culturing the isolated neutrophils of the three groups and measured by ELISA. The optical absorbance measurements showcased increased rates of DNA/MPO complexes in patients with a first clinical episode compared to the other two groups. Finally, the correlation between NET release rates and changes in the percentages of neutrophil subpopulations was investigated and a statistically significant positive correlation was shown between the percentages of aged neutrophils and the percentages of DNA/MPO complexes. In conclusion, it seems that the participation of neutrophils in some of the mechanisms that govern the pathophysiology of MS is possible and they could probably provide a biomarker for the activity of the disease.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
