Η όψιμη μορφή της νόσου Αλτσχάιμερ (Late Onset Alzheimer’s Disease, LOAD) αποτελεί την κύρια
νόσο γνωστικής έκπτωσης στους ηλικιωμένους, επηρεάζοντας έως και το 50% των ατόμων άνω των
80 ετών.2 Οι επικρατούσες θεωρίες σχετικά με την παθογένεση της LOAD περιλαμβάνουν την
υπόθεση του καταρράκτη του αμυλοειδούς, και της υπερ-φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης tau, που
οδηγεί σε συσσωμάτωση και τελικά νευρωνική απώλεια5
, ενώ λιγότερη, αν και αυξανόμενη, έμφαση
δίνεται στην επίμονη εγκεφαλική φλεγμονή, που άγεται από ενεργοποιημένα μικρογλοιακά
κύτταρα21. Μελέτες συσχέτισης γονιδιώματος (Genome Wide Association Studies, GWAS) έχουν
εντοπίσει αρκετούς πολυμορφισμούς ενός νουκλεοτιδίου (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)
που σχετίζονται ισχυρά με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης της LOAD, να αφορούν σε γενετικούς
παράγοντες που έχουν συνδεθεί με τη φαγοκυττάρωση, την επεξεργασία λιπιδίων, και την
ανοσολογική απόκριση26. Χαρακτηριστικά, SNPs κοντά στο γονίδιο Bridging Integrator 1 (BIN1)
παρουσιάζουν ισχυρότερη συσχέτιση με τον κίνδυνο εμφάνισης της LOAD, μετά την
απολιποπρωτεΐνη Ε.31 Η πρωτεΐνη ΒΙΝ1 είναι μέλος της οικογένειας Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR)
πρωτεϊνών – προσαρμογέων, η οποία εμπλέκεται στο δυναμικό της κυτταρικής μεμβράνης32. Ενώ η
ΒΙΝ1 έχει μελετηθεί εκτενώς στους νευρώνες32,60,61, η συμβολή της στη μικρογλοιακή ενεργοποίηση
και στην παθολογία της LOAD παραμένει ασαφής. Τα μικρογλοιακά κύτταρα είναι τα έμφυτα μη-
7
νευρωνικά ανοσοποιητικά κύτταρα του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ), τα οποία
διαδραματίζουν πολύπλευρους ρόλους στη διατήρηση της ομοιόστασης του εγκεφάλου και στην
αντιμετώπιση ασθενειών71. Οι βαθμίδες ενεργοποίησης των μικρογλοιακών κυττάρων επηρεάζονται
από τις κυτταροκίνες και μπορούν είτε να εμποδίσουν είτε να υποστηρίξουν τη νευρωνική ανανέωση,
σε νευρογεννητικές περιοχές97. Επιπλέον, η μικρογλοία επικοινωνεί και ενεργοποιεί τα αστροκύτταρα
προς διαφορικές βαθμίδες ενεργοποίησης, επιδεινώνοντας ή μετριάζοντας νευρωνικές βλάβες121. Ο
ιπποκάμπειος σχηματισμός και οι δίοδοί του προς τον φλοιό αποτελούν κρίσιμα δίκτυα για τη
δημιουργία μνήμης130, και είναι από τις πρώτες περιοχές που επηρεάζονται κατά την εξέλιξη της
LOAD140–142
. Επίσης, η υποκοκκιώδης ζώνη (Subgranular Zone, SGZ) του ιπποκάμπου είναι
νευρογεννητική περιοχή κατά την ενήλικη ζωή του ποντικιού, αφού εκεί λαμβάνει χώρα η Ενήλικη
Ιπποκάμπεια Νευρογένεση (Adult Hippocampal Neurogenesis, ΑΗΝ)
143. Η AHN έχει δειχθεί ότι φθίνει
σημαντικά στα πρώτα στάδια της LOAD, μέσω μηχανισμών που παραμένουν άγνωστοι, ενώ η
έκπτωσή της συνδέεται με την γνωστική κατάσταση των ασθενών191. Ταυτόχρονα είναι γνωστό ότι τα
μικρογλοιακά κύτταρα ρυθμίζουν την AHN, μέσω μηχανισμών που δεν είναι εξ’ ολοκλήρου
κατανοητοί229
.
Προκειμένου να διερευνήσουμε το ρόλο της ΒΙΝ1 στα μικρογλοιακά κύτταρα του ιπποκάμπου
αναπτύξαμε ένα διπλά διαγονιδιακό ζώο (Cx3cr1Cre-ERT2//Bin1fl/fl) , το οποίο επιτρέπει την εκλεκτική
αποσιώπηση της μικρογλοιακής ΒΙΝ1. Συγκεκριμένα, το ποντίκι εκφράζει το γονίδιο της Cre
ρεκομπινάσης υπό τον υποκινητή του CX3CR1 -ένα γονίδιο υποδοχέα που εκφράζεται μόνο στα
μικρογλοιακά κύτταρα του εγκεφάλου και στα μονοκύτταρα της περιφέρειας –, ενώ το ΒΙΝ1 γονίδιο
πλαισιώνεται από περιοχές LoxP – που δυνητικά ανασυνδυάζονται από την ενεργή Cre ρεκομπινάση.
Το παραπάνω σύστημα μας επιτρέπει τον χωρικό έλεγχο της έκφρασης της Cre ρεκομπινάσης, η οποία
περιορίζεται στα μικογλοιακά κύτταρα, στον εγκέφαλο. Το γονίδιο της Cre υπό τον υποκινητή του
CX3CR1 διαθέτει επίσης την γενωμική αλληλουχία που κωδικοποιεί την περιοχή δέσμευσης
προσδετών (Ligand Binding Domain, LBD)του υποδοχέα οιστρογόνων (Estrogen Receptor, ER). Οπότε,
η Cre ρεκομπινάση που παράγεται υπό τον υποκινητή του CX3CR1 είναι δεσμευμένη με τον LBD του
υποδοχέα οιστρογόνων, και αποσυντίθεται στο κυτταρόπλασμα των μικρογλοιακών κυττάρων,
κατόπιν σύνδεσης με τη συνοδό πρωτεΐνη Hsp90. Μέσω αυτής της προσθήκης, μας επιτρέπεται και ο
χρονικός έλεγχος της έκφρασης της Cre. Συγκεκριμένα, στους 3 μήνες ζωής του πειραματικού
ποντικιού, χορηγείται Ταμοξιφαίνη (20 mg/ml) μέσω ενδοπεριτοναϊκών ενέσεων (100 mg/kg) για 4
διαδοχικές μέρες. Η Ταμοξιφαίνη δεσμεύεται στον LBD του υποδοχέα οιστρογόνων, και αποδεσμεύει
αυτόν και την Cre ρεκομπινάση από την Hsp90. Κατόπιν, η Cre ρεκομπινάση μεταβαίνει στον πυρήνα
και ανασυνδυάζει τις περιοχές LoxP, που βρίσκονται εκατέρωθεν του γονιδίου ΒΙΝ1. Ως αποτέλεσμα,
το ΒΙΝ1 αποσιωπείται εκλεκτικά (conditional knockout, cKO), μόνο στα μικρογλοιακά κύτταρα.
8
Ταυτόχρονα, χρησιμοποιούνται ως ομάδα ελέγχου (control), ποντίκια τα οποία διαθέτουν το αγρίου
τύπου γονίδιο CX3CR1, επομένως δεν υπάρχει Cre ρεκομπινάση για να ανασυνδυάσει τις LoxP
περιοχές εκατέρωθεν του ΒΙΝ1 γονιδίου, όταν χορηγηθεί Ταμοξιφαίνη. Προκειμένου να μελετήσουμε
τη μικρογλοιακή αποσιώπηση της ΒΙΝ1 στον ιππόκαμπο, τόσο υπό ομοιοστατικές όσο υπό
φλεγμονώδεις συνθήκες, χορηγήσαμε επιπλέον σε πειραματικά ποντίκια και ποντίκια ελέγχου μια
εφάπαξ δόση λιποπολυσακχαρίτη (LPS), με σκοπό την πρόκληση φλεγμονώδους απόκρισης.
Στο μοντέλο μας, προχωρήσαμε με τεχνικές ανοσοϊστοχημείας και μοριακής βιολογίας σε μελέτη της
περιοχής του ιπποκάμπου και συγκεκριμένα της οδοντωτής έλικας (Dentate Gyrus, DG), που περιέχει
τη νευρογεννητική SGZ. Πειράματα ανοσοϊστοχημείας στην DG έδειξαν ότι παρουσία LPS και απουσία
ΒΙΝ1, αυξήθηκε ο αριθμός των πολλαπλασιαζόμενων μικρογλοιακών κυττάρων (ΙΒΑ1+/ΚΙ67+), ενώ
δημιουργήθηκε μια τάση αυξορύθμισης προφλεγμονοδών γονιδίων που σχετίζονται με την τύπου Ι
απόκριση ιντερφερόνης σε ολόκληρο τον ιπποκάμπειο σχηματισμό. Ωστόσο, ο πληθυσμός των
μικρογλοιακών κυττάρων παρέμεινε σταθερός στις 4 συνθήκες (control, control+LPS, conditional
knockout, conditional knockout+LPS). Υπό φλεγμονώδεις συνθήκες, το φαγοκυτταρικό δυναμικό των
μικρογλοιακών κυττάρων, σηματοδοτούμενη από το λυσοσωμικό δείκτη CD68203
, ενεργοποιείται,
ωστόσο τα μικρογλοιακά κύτταρα δεν υιοθετούν την αναμενόμενη ενεργοποιημένη διευρυμένη
μορφολογία, σύμφωνα με την ένταση φθορισμού του μικρογλοιακού δείκτη ΙΒΑ1198, απουσία του
ΒΙΝ1. Από την άλλη, τα αστροκύτταρα, τα οποία φυσιολογικά αλληλεπιδρούν με τη μικρογλοία στον
ιππόκαμπο του ποντικιού, υιοθετούν περισσότερο διευρυμένη μορφολογία, που σηματοδοτείται
από την ένταση φθορισμού του αστροκυτταρικού δείκτη GFAP205, μετά την έκθεση σε LPS, στους
ιπποκάμπους ποντικιών που δεν εκφράζουν μικρογλοιακή ΒΙΝ1. Τέλος, τα αποτελέσματά μας
υποδεικνύουν ότι η διαγραφή του μικρογλοιακού ΒΙΝ1 μεταβάλει τον πληθυσμό των DCX+
νευροβλαστών210 στην SGZ του ιπποκάμπου του ποντικιού, υπό ομοιοστατικές συνθήκες, πιθανώς
λόγω διαταραχής του φαγοκυτταρικού δυναμικού της μικρογλοίας.
Συνολικά, τα πρώιμα ευρήματά μας σχετικά με τον πολλαπλασιασμό, τη μορφολογία και το
φαγοκυτταρικό δυναμικό της μικρογλοίας σε φλεγμονώδες περιβάλλον σκιαγραφούν ένα φαινότυπο
όπου η εκλεκτική αποσιώπηση του ΒΙΝ1 προκαλεί (1) πολλαπλασιασμό των μικρογλοιακών
κυττάρων, πιθανώς λόγω απουσίας αλληλεπιδράσεων ΒΙΝ1-MYC στα κύτταρα αυτά213, (2)
παρεμπόδιση της υιοθέτησης ενεργοποιημένης, διευρυμένης μικρογλοιακής μορφολογίας, πιθανώς
λόγω της έλλειψης επίδρασης της ΒΙΝ1 στη λιπιδική μεμβράνη32,44 και τον κυτταροσκελετό45 των
κυττάρων, και, (3) συσσώρευση λυσοσωμάτων τα οποία δεν είναι σε θέση να σχηματίσουν
φαγολυσοσώματα67,68,στο κυτταρόπλασμα των μικρογλοιακών κυττάρων. Ταυτόχρονα,
χαρακτηριστικά ευρήματα της LOAD όπως η έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την τύπου Ι
απόκριση ιντερφερόνης118,222,223 και η αστρογλοίωση127, είναι εμφανέστερα παρουσία LPS και
9
απουσία μικρογλοιακής ΒΙΝ1. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να επιβεβαιώσουν περεταίρω αυτά τα
ευρήματα, στοχεύοντας στην αποσαφήνιση των υποκείμενων μηχανισμών που ευθύνονται για τις εν
λόγω αλλαγές. Τέλος, τα αποτελέσματά μας, δείχνουν ότι η διαταραχή του φαγοκυτταρικού
δυναμικού των μικρογλοιακών κυττάρων, όπως αυτή που προκαλείται στο μοντέλο μας, μπορεί να
οδηγήσει σε τροποποιήσεις νεογέννητων νευρωνικών πληθυσμών στον ιππόκαμπο. Αυτό το εύρημα
ενδεχομένως παρέχει πληροφορίες για τα προβλήματα στην ΑΗΝ που παρατηρούνται στη LOAD.
(EL)
The hippocampal formation and its cortical inputs – crucial areas for memory formation – are affected early in the development of Late Onset Alzheimer’s Disease (LOAD). Adult Hippocampal Neurogenesis (AHN), taking place in the hippocampal Dentate Gyrus (DG), declines drastically during preliminary stages of LOAD, via unidentified mechanisms, and correlates to the cognitive status of patients. Microglia, the innate immune cells that actively remodel AHN, express protein isoforms encoded by genes whose Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) have been linked to LOAD by Genome-Wide Association Studies (GWAS). Notably, SNPs near the Bridging Integrator 1 gene, encoding the BAR protein member BIN1, have been significantly associated with an elevated risk for LOAD development, surpassed only by Apolipoprotein E. Microglial BIN1 is related to the endolysosomal network – a system which is necessary for microglial phagocytosis, and modulation of AHN. To explore the role of microglial BIN1 in hippocampal homeostasis and AHN, we generated a double transgenic mouse model (Cx3CR1Cre-ERT2//Bin1fl/fl) which allows the conditional knockout (cKO) of BIN1 in microglial cells. To investigate microglial BIN1 deletion in the murine hippocampus in homeostasis and inflammation, we treated both control and microglial BIN1 cKO mice with lipopolysaccharide (LPS), a well-characterized inducer of inflammatory response. Immunohistochemical experiments indicated that microglial BIN1 deletion combined with LPS stimulation increases the proliferative capacity of DG microglia and evokes an upregulation trend of type I IFN pro-inflammatory genes in the entire hippocampal formation. Concurrently, BIN1 ablation triggers the phagocytic potential of microglial cells, which however do not adopt the anticipated activated enlarged morphology. On the other hand, astrocytes, which physiologically interact with microglia in the mouse hippocampus, adopt an enlarged morphology upon LPS exposure, in hippocampi lacking BIN1. Importantly, our results indicate that microglial BIN1 deletion alters the neuroblast population in the neurogenic Subgranular Zone of the mouse hippocampus, under homeostatic conditions, probably due to a disruption in microglial phagocytic potential. Taken together, our results indicate that BIN1 exhibits a cell-type specific role in microglia, affecting their inflammatory response to LPS and homeostatic modulation of AHN.
Key words: hippocampus, Late Onset Alzheimer’s Disease, Adult Hippocampal Neurogenesis, microglia, BIN1, microglial phagocytosis, conditional knockout, mouse models, lipopolysaccharide (LPS), type I interferon, inflammation
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
