Ανίχνευση απλοτύπου Η1 στο ΜΑΡΤ γονίδιο σε βιολογικά υγρά ασθενών με άνοιες:
Εισαγωγή – Σκοπός: Η μετωποκροταφική άνοια (Frontotemporal Dementia, FTD) μπορεί να είναι είτε οικογενής (30-50%) είτε σποραδική και είναι το ίδιο συχνή με την νόσο Alzheimer’s σε άτομα ηλικίας <65 ετών. Μεταξύ των πολλών γονιδίων που ενέχονται στη νόσο είναι και το γονίδιο MAPT (microtubule – associated protein tau) το οποίο μεταγράφεται σε 3R/4R ισομορφές, αναλόγως εάν περιέχει τρεις ή τέσσερις επαναλήψεις των περιοχών δέσμευσης των μικροσωληνίσκων. Μεταλλάξεις στο γονίδιο MAPT ή διατάραξη της φυσιολογικής αναλογίας 1:1 των 3R/4R ισομορφών -και κατά συνέπεια της ισορροπίας των μικροσωληνίσκων των νευρικών κυττάρων- οδηγούν σε FTD. Σκοπός της εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθοδολογίας ανίχνευσης MAPT DNA παραλλαγών σε Έλληνες FTD ασθενείς με τις μεθοδολογίες DNA Sequencing και MLPA, η σύγκριση των αποτελεσμάτων με NGS συνεργαζόμενου εργαστηρίου και η αξιολόγηση των ευρημάτων σε FTD ασθενείς.
Υλικά και μέθοδοι: Αρχικά απομονώθηκε DNA με High Pure Template Kit (Roche) από περιφερικό αίμα 20 FTD Ελλήνων ασθενών, μετά από έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεσή τους. Πραγματοποιήθηκε σχεδιασμός ειδικών εκκινητών για την DNA ενίσχυση και αλληλούχιση 11 εξωνίων. Μετά την PCR ενίσχυση, ακολούθησε Cycle Sequencing (Big Dye Terminator v3.1) και ηλεκτροφόρηση των τελικών προϊόντων στον SeqStudio γενετικό αναλυτή (Thermo ABI). Επίσης, η MLPA μέθοδος πραγματοποιήθηκε για την ανίχνευση τυχόν μεγάλων DNA αναδιατάξεων (MRC Holland). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τα προγράμματα Chromas, NovoSNP και Coffalyzer.
Αποτελέσματα: Στη σύγκριση αποτελεσμάτων μεταξύ των δύο εργαστηρίων παρατηρήθηκε σχεδόν πλήρης ταύτιση. Στα 10 από τα 20 δείγματα, ανιχνεύθηκαν οι ίδιες 5 καλοήθεις παραλλαγές. Οι 2 από αυτές είναι ιντρονικές (rs75242405-rs1800547) και οι 3 είναι συνώνυμες εξωνικές (rs1052551-rs1052553-rs17652121). Οι τέσσερις από τους πέντε πολυμορφισμούς αποτελούν μέρος του απλοτύπου Η1.
Συμπεράσματα: Η επαλήθευση της αναπτυχθείσας μεθόδου για την ανίχνευση των ΜΑΡΤ παραλλαγών κρίνεται ικανοποιητική. Στο 50% των FTD ασθενών ανιχνεύθηκε ο MAPT Η1 απλότυπος ο οποίος συνδέεται με αυξημένη έκφραση της 4R ισομορφής η οποία δεσμεύεται πιο ισχυρά στους μικροσωληνίσκους. Η ανάλυση περισσότερων δειγμάτων FTD Ελλήνων ασθενών θα βοηθούσε ώστε να αποκαλυφθεί επακριβώς ο ρόλος του απλοτύπου Η1 στην ανάπτυξη υποτύπων της νόσου (π.χ. άτυπες παρκινσονικές μορφές).
Επαλήθευση μεθόδου μέτρησης βιοδεικτών σε βιολογικά υγρά ασθενών με άνοιες:
Εισαγωγή: Οι πρωτεΐνες του Εγκεφαλονωτιαίου Υγρού (ΕΝΥ), β-αμυλοειδές (αβ42), ολική tau και φωσφορυλιωμένη tau (p-tau181), αποτελούν σήμερα αξιόπιστους βιοδείκτες για την ανίχνευση αμυλοειδικών πλακών, νευροεκφυλισμού και συσσωματωμάτων tau πρωτεΐνης που οδηγούν σε νευροϊνιδιακά δεμάτια σύμφωνα με την ταξινόμηση AT(N) 2018 των νευροεκφυλιστικών ανοιών. Η αυτοματοποίηση τέτοιων ανοσοχημικών μετρήσεων θα οδηγήσει σε αύξηση της ακρίβειας των μεθόδων και της ευρύτερης χρήσης τους σε παγκόσμιο επίπεδο.
Υλικά και μέθοδοι: Συλλέχθησαν 27 δείγματα ΕΝΥ από ασθενείς που ανήκουν στο φάσμα του νευροεκφυλισμού (Νόσος Alzheimer, Μετωποκροταφική άνοια κτλ.) και αναλύθηκαν στη συνέχεια για τους ανωτέρω βιοδείκτες τόσο με τη μέθοδο αναφοράς ELISA (Innotest Fujirebio), όσο και με τα νέα CE-IVD αντιδραστήρια της Roche για τον αυτόματο αναλυτή Elecsys. Ένα δείγμα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας, συμπεριλήφθηκε επίσης.
Αποτελέσματα: Οι νέες μέθοδοι της Roche, είναι εύκολες στην εφαρμογή τους, ταχείες (τα αποτελέσματα δίνονται μέσα σε 18 λεπτά σε σύγκριση με τις 20 ώρες της χειροκίνητης ELISA) και παρουσιάζουν εξαιρετικά αποτελέσματα πιστότητας (εξαιρετικά χαμηλός συντελεστής μεταβλητότητας τόσο στα χαμηλά όσο και στα υψηλά δείγματα ελέγχου CV% <5% σε σύγκριση με το 8-12% της ELISA). Στατιστικές αναλύσεις συσχέτισης (correlation), παλινδρόμησης (regression) και συμφωνίας (concordance) πραγματοποιήθηκαν για κάθε μία από τις παραμέτρους, από όπου προέκυψαν οι ακόλουθες εξισώσεις: α) αβ42Roche=1,18 x αβ42Fujirebio-94 (r=0,91, συμφωνία 70%), β) ολική tauRoche=0,65 x ολική tauFujirebio+7 (rho=0,87, συμφωνία 96%) και γ) p-tau181Roche=0,56 x p-tau181Fujirebio-9 (rho=0,93, συμφωνία 81%). Για να είναι δίκαιη η σύγκριση μεθόδων, ο διαχωρισμός του φυσιολογικού από το μη-φυσιολογικό αποτέλεσμα (normal/abnormal), πραγματοποιείται με τη βοήθεια των cut-offs ορίων της βιβλιογραφίας για τη
Fujirebio (550, 375, 52 pg/ml για αβ42, ολική tau και p-tau181 αντίστοιχα, αν και ο κατασκευαστής προτείνει και διαχωρισμό με βάση την ηλικία) και για τη Roche 800, 300, 27 pg/ml αντίστοιχα (προτεινόμενα από τη Roche εκτός του cut-off του αβ42, το οποίο αυθαίρετα μετατράπηκε από 1000 σε 800 pg/ml ώστε να βελτιωθεί η συμφωνία των δύο μεθόδων).
Συμπεράσματα: Οι δύο μέθοδοι παρέχουν στατιστικά σχετιζόμενα αποτελέσματα για τις παραμέτρους ολική tau και p-tau181× το cut-off που παρέχει η Roche για την ολική tau είναι κατάλληλο για τον διαχωρισμό των περιπτώσεων, ενώ το όριο της p-tau181 χρειάζεται μικρή βελτίωση για να αυξηθεί η συμφωνία των μεθόδων. Οι τιμές του αβ42, φαίνεται να συγκλίνουν στην αποδεκτή συσχέτιση και ισοδυναμία, παρόλα αυτά, η τιμή των ορίων και για τις δύο μεθόδους χρειάζεται επανεξέταση καθώς πρέπει να ληφθεί υπόψιν το νέο πιστοποιημένο υλικό αναφοράς. Παρόλα αυτά η τελική και ορθή ταξινόμηση των περιπτώσεων άνοιας με βάση τους βιοδείκτες ΕΝΥ θα πρέπει να γίνεται σε συνδυασμό με την κλινική εικόνα του ασθενούς και την παρακολούθησή τους. Επιβάλλεται η συνεχής προσπάθεια προς βελτίωση της μέτρησης αυτών των παραμέτρων, με σκοπό την τυποποίηση και εναρμόνιση των μεθόδων σε παγκόσμια κλίμακα.
(EL)
Detection of Η1 haplotype in ΜΑΡΤ gene in biological fluids of dementia patients:
Introduction: Frontotemporal Dementia (FTD) may be either familial (30-50%) or sporadic and is as common as Alzheimer’s in people <65 years old. Among the many genes involved in the disease, is the MAPT gene (microtubule-associated protein tau) which is transcribed into 3R/4R protein isoforms, depending on whether they contain 3 or 4 repeats of microtubule binding domains. MAPT gene mutations or disturbance of the normal 1:1 ratio of 3R/4R isoforms -and consequently the microtubule balance of nerve cells- leads to FTD. The purpose of this study is the development of methodology for detection MAPT DNA mutations in Greek FTD patients with DNA Sequencing and MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), comparison of the results with NGS method of another collaborating laboratory abroad and evaluation of findings in FTD patients.
Patients and methods: In 20 well-ascertained FTD patients, EDTA blood was collected after obtaining their informed signed consent. DNA isolation was performed with the High Pure PCR Template Kit (Roche). Specific primers were designed for DNA amplification and sequencing of the amplicons of 11 MAPT exons. Then cycle sequencing (Big Dye Terminator v3.1) and electrophoresis of the purified products in the SeqStudio genetic analyzer (Thermo ABI) was executed. Also, MLPA methodology was performed in all samples to detect large rearrangements of the MAPT gene (MRC Holland). Results were analyzed with bioinformatics software Chromas, NovoSNP and Coffalyzer.
Results: Agreement between the two laboratories was largely found. The same 5 benign polymorphisms were detected in 10/20 samples. Two of them are intronic (rs75242405, rs1800547) and three of them are synonymous exonic (rs1052551, rs1052553, rs17652121). Four of these five polymorphisms belong to the H1 haplotype.
Conclusions: The verification of the developed method for detection of MAPT alterations is considered satisfactory. In 50% of the FTD patients, the MAPT H1 haplotype was detected. It has been correlated with increased expression of 4R isoforms that bind more tightly to microtubules. The analysis of more Greek FTD patients, would assist investigating the role of the H1 haplotype in the development of subtypes of the disease (e.g. presentation with atypical Parkinsonian syndromes).
Method Verification for the measurement of biomarkers in biological fluids of dementia patients:
Objectives. CSF proteins amyloid beta (ab42), total tau and p-tau181 are now considered reliable biomarkers of amyloid plaque formation, neurodegeneration and tau aggregation resulting in neurofibrillar tangles according to the recent AT(N) 2018 classification of neurodegenerative dementias. The automation of these immunochemical measurements will increase both accuracy and widespread application.
Materials and Methods. 27 CSF samples from patients from the neurodegenerative spectrum (Alzheimer’s disease, Frontotemporal Dementia etc.) were analyzed for the aforementioned CSF biomarkers with the gold-standard Innotest ELISA methods from Fujirebio and in parallel, with the new CE-IVD Roche reagents that employ the Elecsys automated platform. An external quality assessment sample was also included.
Results. The new Roche reagents are easy to implement, rapid (results within 18 min compared to 20 hours for the ELISA manual procedures) and showed excellent precision results (CV% of internal low- and high-quality controls <5% compared to 8-12% for ELISA). Regression, correlation, and concordance statistical analysis showed the following results: a) ab42Roche= 1.18 x ab42Fujirebio -94 (r=0.91, concordance 70%), b) total tauRoche= 0.65 x total tauFujirebio+7 (rho=0.87, concordance 96%) c) p-tau181Roche=0.56 x p-tau181Fujirebio-9 (rho=0.93, concordance 81%). For a fair method comparison to be performed, normal/abnormal result concordance was evaluated according to literature universal cut-offs for Fujirebio (550, 375, 52 pg/ml for ab42, total tau, p-tau181 although the manufacturer provides age-specific cut-offs) and for Roche 800, 300, 27 pg/ml correspondingly (as suggested by Roche except for the ab42, that was changed arbitrarily from 1000 to 800 pg/ml to improve concordance).
Conclusions. Our results showed high correlation for the total tau and p-tau181 methods; the Roche total tau cut-off seems appropriate for correct classification of the cases and the Roche p-tau181 cut-off needs slight adjustment for the concordance to improve. Ab42 values seem to converge with acceptable correlation and equivalence but the cut-off value of the two methods need to be re-examined considering the new certified ab42 reference material. Final and correct adjudication of the dementia cases according to CSF biomarkers should include clinical examination and patient monitoring. Efforts for standardization and harmonization of methods for these CSF parameters should continue worldwide.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
