Οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες αποτελούν έναν πολύπλοκο κλάδο των νευρολογικών παθήσεων, των οποίων η παθοφυσιολογία παραμένει ασαφής. Η νόσος του Alzheimer (AD) είναι μία από τις πιο συχνές νευροεκφυλιστικές διαταραχές που σχετίζονται με την ηλικία ή με κληρονομικές μεταλλάξεις. Η εξέλιξη της AD συνδέεται με τη συσσώρευση κυτταροτοξικού πεπτιδίου του β-αμυλοειδούς (Aβ) και της υπερφωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης tau σε συνδυασμό με άλλα παθολογικά χαρακτηριστικά, όπως η απώλεια συναπτικής λειτουργίας, ο ελαττωματικός μεταβολισμός της ενέργειας, οι ανισορροπίες στην ομοιόσταση των πρωτεϊνών και των μετάλλων. Η πρόδρομη πρωτεΐνη του αμυλοειδούς (APP) είναι μια μεμβρανική πρωτεΐνη που θεωρείται ότι διαδραματίζει κύριο ρόλο στην παθολογία της νόσου. Είναι γνωστό ότι η APP σε φυσιολογικές συνθήκες ακολουθεί μια μη αμυλοειδογόνο πορεία- ωστόσο, μπορεί να προχωρήσει σε ένα αμυλοειδογενές μονοπάτι, το οποίο οδηγεί στη δημιουργία εξωκυτταρικών επιβλαβών πλακών Aβ. H δεύτερη πιο κοινή νευροεκφυλιστική διαταραχή είναι η νόσος του Parkinson. H α-συνουκλεΐνη είναι μια προσυναπτική νευρωνική πρωτεΐνη που συνδέεται γενετικά και νευροπαθολογικά με τη νόσο του Parkinson (PD). Πιστεύεται ότι οι ανώμαλες διαλυτές ολιγομερείς διαμορφώσεις της, τα λεγόμενα πρωτοϊνίδια, είναι τα τοξικά είδη που μεσολαβούν για τη διαταραχή της κυτταρικής ομοιόστασης και τον νευρωνικό θάνατο, μέσω επιδράσεων σε διάφορους ενδοκυτταρικούς στόχους, συμπεριλαμβανομένης της συναπτικής λειτουργίας. Επιπλέον, η εκκρινόμενη α-συνουκλεΐνη μπορεί να ασκεί επιβλαβείς επιδράσεις στα γειτονικά κύτταρα, συμβάλλοντας έτσι ενδεχομένως στη διάδοση της νόσου. Η πρωτεΐνη αυτή είναι άφθονη στα νευρικά κύτταρα που παράγουν ντοπαμίνη και συγκεντρώνεται ιδιαίτερα στον εγκέφαλο. H ανάδειξη της DDC ως ένα πιθανό βιοδείκτη των Παρκινσονικών διαταραχών, φέρνει στο προσκήνιο την αναγκαιότητας της περαιτέρω μελέτης του αναδυόμενου πολύπλοκου ρόλου του ενζύμου. Είναι ευρέως γνωστό πως η DDC αποτελεί το ένζυμο μετατροπής της L-DOPA σε ντοπαμίνη στο μονοπάτι βιοσύνθεσης κατεχολαμινών. Στην παρούσα διπλωματική εργασία έγινε προσπάθεια να προσδιοριστεί η επίδραση του ενζύμου της DDC στην πρωτεολυτική επεξεργασία της προδρόμου πρωτεΐνης του αμυλοειδούς (APP) αλλά και στα επίπεδα έκφρασης και συσσωμάτωσης των ολιγομερών μορφών της ενδογενούς α-συνουκλεΐνης σε συνάρτηση με οξειδωτικές (Η2Ο2) και αντιοξειδωτικές (l-ascorbic acid) συνθήκες. Το κυτταρικό σύστημα που χρησιμοποιήθηκε αποτελεί μοντέλο προσομοίωσης των ντοπαμινεργικών νευρώνων. Επιλέχθηκε η κυτταρική σειρά CHO-K1 η οποία είναι απαλλαγμένη από τα ένζυμα και τις πρωτεΐνες που σχετίζονται με την παραγωγή και το μεταβολισμό των κατεχολαμινών που συναντώνται σε όλα τα κύτταρα νευρικού τύπου. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων, στο παραπάνω κυτταρικό σύστημα έγινε επιμόλυνση με το cDNA της ανθρώπινης DDC. Το σύνολο των αποτελεσμάτων που παρουσιαστήκαν στην παρούσα διπλωματική εργασία επιβεβαιώνει την εμπλοκή του ενζύμου της DDC στον νευροεκφυλισμό τόσο στη νόσο Alzheimer όσο και στη νόσο του Parkinson, ενισχύοντας την άποψη πως νευροεκφυλιστικές νόσοι έχουν κοινή μοριακή βάση. Βάση των αποτελεσμάτων, καταδεικνύεται η αντίσταση που προκαλείται από το ένζυμο της DDC προς τον κυτταρικό θάνατο υπό την επίδραση της οξειδωτική καταπόνησης και κατά επέκταση η πιθανή συμμετοχή του ενζύμου στον μηχανισμό της οξειδωτικής καταπόνησης. Οι παρατηρήσεις μας επιβεβαιώνουν τον διττό ρόλο του ασκορβικού οξέος ενώ αναδύουν ένα πιθανό φραγμό που προκύπτει από την δράση του ασκορβικού οξέος προς τον ρόλο της DDC. Επιπρόσθετα, οι παρατηρήσεις μας υποδηλώνουν πως η DDC ενδεχομένως να εμπλέκεται στην πρωτεολυτική διαδικασία αλλά και να καθοδηγεί την πρωτεόλυση της APP προς την αμυλοειδογενής οδό. Τέλος, τα κύτταρα τα οποία είχαν επιμολυνθεί με το ανθρώπινο cDNA της DDC εμφάνισαν μια τάση προς την επαγωγή της συσσωμάτωσης της α-συνουκλεΐνης.Κρίνεται αναγκαία λοιπόν, η περαιτέρω μελέτη του πολύπλοκου ρόλου της DDC.
(EL)
Neurodegenerative diseases are a complex branch of neurological diseases whose pathophysiology remains unclear. Alzheimer's disease (AD) is one of the most common neurodegenerative disorders associated with age or inherited mutations. The progression of AD is associated with accumulation of cytotoxic β-amyloid (Aβ) peptide and hyperphosphorylated tau protein in combination with other pathological features such as loss of synaptic function, defective energy metabolism, imbalances in protein and mineral homeostasis. Amyloid precursor protein (APP) is a membrane protein thought to play a major role in the pathology of the disease. It is known that APP under normal conditions follows a non-amyloidogenic pathway; however, it can proceed in an amyloidogenic pathway, which leads to the formation of extracellular deleterious Aβ plaques. The second most common neurodegenerative disorder is Parkinson's disease. A-synuclein is a presynaptic neuronal protein that is genetically and neuropathologically linked to Parkinson's disease (PD). Its abnormal soluble oligomeric conformations, so-called protofibrils, are believed to be the toxic species that mediate cellular homeostasis disruption and neuronal death through effects on various intracellular targets, including synaptic function. In addition, secreted α-synuclein may exert deleterious effects on neighbouring cells, thereby potentially contributing to disease dissemination. This protein is abundant in dopamine-producing nerve cells and is particularly concentrated in the brain. The emergence of DDC as a potential biomarker of Parkinsonian disorders brings to the fore the necessity of further study of the emerging complex role of the enzyme. It is well known that DDC is the enzyme for the conversion of L-DOPA to dopamine in the catecholamine biosynthesis pathway. In the present thesis, an attempt was made to determine the effect of the DDC enzyme on the proteolytic processing of the amyloid precursor protein (APP) and on the expression and aggregation levels of oligomeric forms of endogenous α-synuclein as a function of oxidative (H2O2) and antioxidant (l-ascorbic acid) conditions. The cell system used is a simulated model of dopaminergic neurons. The CHO-K1 cell line was chosen which is devoid of the enzymes and proteins associated with the production and metabolism of catecholamines found in all neuronal cells. To conduct the experiments, the above cell system was co-infected with human DDC cDNA. The set of results presented in this thesis confirms the involvement of the DDC enzyme in neurodegeneration in both Alzheimer's and Parkinson's disease, supporting the view that neurodegenerative diseases have a common molecular basis. Based on the results, we demonstrate the resistance induced by the DDC enzyme to cell death under oxidative stress and, by extension, the possible involvement of the enzyme in the mechanism of oxidative stress. Our observations confirm the dual role of ascorbic acid while highlighting a possible barrier resulting from the action of ascorbic acid towards the role of DDC. In addition, our observations suggest that DDC may be involved in the proteolytic process but also guides the proteolysis of APP towards the amyloidogenic pathway. Finally, cells that were infected with human DDC cDNA showed a tendency towards induction of α-synuclein aggregation.Thus, further study of the complex role of DDC seems necessary.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
