Η κοιλιάκη είναι η πιο συνηθισμένη αυτοάνοση διαταραχή του λεπτού εντέρου, επηρεάζοντας το 1-2% του πληθυσμού. Εμφανίζεται σε γενετικά προδιατεθειμένα άτομα και οφείλεται σε ανοσολογική απόκριση των T-κυττάρων στη γλουτένη, μια πρωτεΐνη που περιέχεται στο σιτάρι, το κριθάρι και τη σίκαλη. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μεταγονιδιωματική μελέτη της σχέσης του μικροβιώματος του εντέρου με την εμφάνιση και εξέλιξη της νόσου, που θα μας οδηγήσει σε πιο κατάλληλες μεθόδους πρόληψης και θεραπείας. Πραγματοποιήσαμε απομόνωση μικροβιακού DNA από κόπρανα υγιών και ασθενών. Στη συνέχεια έγινε ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης πέντε γονιδίων μοναδικών για κάθε ένα από πέντε είδη μικροβίων της φυσιολογικής μικροχλωρίδας του εντέρου. Τα είδη που μελετήθηκαν ήταν τα Escherichia coli, Salmonella enterica, Akkermansia muciniphila, Clostridioides difficile, Clostridium perfringens. Η μέθοδος που χρησιμοποιήθηκε ήταν η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (qRT-PCR). Τα δείγματα που αναλύθηκαν ήταν 20 υγιών ατόμων και 25 ασθενών που ακολουθούσαν διατροφή χωρίς γλουτένη και τα συμπτώματά τους βρίσκονταν σε ύφεση.
Για το Clostridium perfringens παρατηρήθηκε αύξηση στην έκφραση του γονιδίου στους ασθενείς κατά 0.93 φορές (fold=0.93) από ότι στους υγιείς, αποτέλεσμα όμως που δεν αναδείχθηκε στατιστικά σημαντικό (p=0.08). Για το Clostridioides difficile δεν παρατηρήθηκε έκφραση του γονιδίου του ούτε σε υγιείς ούτε σε ασθενείς, αποτέλεσμα όμως που χρίζει περαιτέρω διερεύνησης. καθώς δεν αναδείχθηκε στατιστικά σημαντικό. Για τους μικροοργανισμούς Akkermansia muciniphila, Escherichia coli και Salmonella enterica είχαμε στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα με p-values 0.009, 0.046 και 0.0001, αντίστοιχα. Για τους τρεις πληθυσμούς των μικροβίων αυτών παρατηρήθηκε μείωση στους ασθενείς σε σχέση με τους υγιείς κατά 1.16, 1.1 και 1.17 φορές, αντίστοιχα. Στους άντρες ασθενείς είχαμε στατιστικά σημαντική μείωση της έκφρασης του Salmonella enterica σε σχέση με τους υγιείς κατά 1.2 φορές. Επίσης, μικρή διαφορά του πληθυσμού μεταξύ αντρών-γυναικών, όπου είχαμε μεγαλύτερη έκφραση κατά 1.07 φορές στις γυναίκες (p=0.0006). Για τους ασθενείς παρατηρήθηκε μικρή αύξηση των πληθυσμών Akkermansia muciniphila και Escherichia coli στους άντρες παρόλα αυτά τα αποτελέσματα αυτά δεν ήταν στατιστικά σημαντικά. Στην περίπτωση του Salmonella enterica είχαμε μεγαλύτερο πληθυσμό στους άντρες ασθενείς σε σχέση με τις γυναίκες (p=0.04). Τα αποτελέσματα αυτά συνάδουν με την υπάρχουσα βιβλιογραφία, καθώς οι πληθυσμοί της μικροχλωρίδας του εντέρου βρίσκονται σε δυσβίωση στους ασθενείς με κοιλιοκάκη. Η μελέτη αυτή συμβάλλει στην κατανόηση του ρόλου του μικροβιώματος στην υγεία του εντέρου σε ασθενείς με κοιλιοκάκη. Με αυτόν τον τρόπο γίνεται προσπάθεια συσχέτισης των αλλαγών που παρατηρήθηκαν στους μικροβιακούς πληθυσμούς των πέντε υπό μελέτη ειδών με την παθογένεση της νόσου, με στόχο την ανάπτυξη νέων μεθόδων έγκαιρης διάγνωσης καθώς και την ανάπτυξη νέων αποτελεσματικών θεραπειών για την κοιλιοκάκη. Η μελέτη επιβεβαιώνει πως η κοιλιοκάκη συσχετίζεται με αλλαγές στο μικροβίωμα του εντέρου. Τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν πως οι αλλαγές διαφέρουν ανάμεσα στα φύλα και πως μικροβιακοί πληθυσμοί ωφέλιμοι για το ανθρώπινο έντερο παρουσιάζουν μείωση στους ασθενείς με κοιλιοκάκη.
(EL)
Celiac disease is the most common autoimmune disorder of the small intestine, affecting 1-2% of the population. It occurs in genetically predisposed individuals and is due to a T-cell immune response to gluten, a protein found in wheat, barley and rye. The purpose of this thesis is the metagenetic study of the relationship of the gut microbiome with the onset and progression of the disease, which will help us in more appropriate methods of treatment and prevention. We isolated microbial DNA from stools of healthy people and patients. The gene expression of five genes unique to each of five microbial species of the normal gut microbiota was then analysed. The species studied were Escherichia coli, Salmonella enterica, Akkermansia muciniphila, Clostridioides difficile, Clostridium perfringens. The method used was quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The samples analysed were 20 healthy subjects and 25 patients who followed a gluten-free diet and whose symptoms were in remission.
For Clostridium perfringens, an increase in gene expression was observed in the patients by 0.93 times (fold=0.93) greater than in the healthy, but this result was not statistically significant (p=0.08). For Clostridioides difficile, no expression of its gene was observed in either healthy or sick patients, a result that needs further investigation. For the microorganisms Akkermansia muciniphila, Escherichia coli and Salmonella enterica we had statistically significant results with p-values of 0.009, 0.046 and 0.0001, respectively. For the three populations of these microbes, a reduction was observed in the patients compared to the healthy by 1.16, 1.1 and 1.17 times, respectively. For men, we had a statistically significant decrease in the expression of Salmonella enterica in the patients compared to the healthy by 1.2 times. Also, small population difference was detected between men and women where we had a 1.07 times higher expression in women (p=0.0006). For patients, a small increase in Akkermansia muciniphila and Escherichia coli populations was observed in men, however these results were not statistically significant. In the case of Salmonella enterica, we had a larger population of S. enterica in male patients compared to female patients (p=0.04). These results are consistent with the existing literature, as gut microflora populations are unregulated in patients with celiac disease. This study contributes to the understanding of the role of the microbiome in gut health in patients with celiac disease. In this way, an attempt is made to correlate the changes observed in the microbial populations of the five species under study with the pathogenesis of the disease, trying to develop new methods of early diagnosis as well as new effective treatments for celiac disease. The study confirms that celiac disease is associated with changes in the gut microbiome. Our results highlight that changes differ between sexes and that microbial populations beneficial to the human gut are reduced in celiac disease patients.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
