Ο καρκίνος των ωοθηκών αποτελεί έναν γενικό όρο για να περιγράψει μια σειρά από μοριακά και αιτιολογικά διακριτές ασθένειες που απλά μοιράζονται την ίδια ανατομική περιοχή. Αποτελεί μια γυναικολογική κακοήθεια που έρχεται 2η σε διάγνωση στις ανεπτυγμένες χώρες και η 1η σε όσον αφορά την αναλογία περιστατικού/θανάτου. Σε προχωρημένα στάδια της νόσου διαγιγνώσκεται περίπου το 70% των ασθενών. Τα τελευταία χρόνια, η επιβίωση των ασθενών έχει βελτιωθεί, με την 5ετή επιβίωση να φτάνει το 46%. Ωστόσο, η απουσία κατάλληλης μεθόδου για την έγκαιρη διάγνωση των ασθενών απουσιάζει, με αποτέλεσμα η επιβίωση να είναι ακόμα χαμηλή. Ο καρκίνος των ωοθηκών αποκαλείται συχνά και ως ο «σιωπηλός δολοφόνος» διότι δεν εμφανίζεται ειδικά συμπτώματα στα αρχικά στάδια της νόσου. Ως αποτέλεσμα, το 80% των περιπτώσεων με αυτού του είδους τα συμπτώματα οδηγείται σε διάγνωση σε προχωρημένα στάδια. Η εύρεση νέων βιοδεικτών στον καρκίνο των ωοθηκών αποτελεί μια υψίστης σημασίας διαδικασία που αφορά τη διάγνωση, τη διαχείριση των ασθενών, την εύρεση στοχευμένης και αποτελεσματικής θεραπείας, την κατηγοριοποίηση των ασθενών ανάλογα την ανταπόκρισή τους σε αυτήν καθώς και την εύρεση της επανεμφανιζόμενης νόσου. Διάφορες ερευνητικές μελέτες έχουν αναδείξει πολλούς υποσχόμενους βιοδείκτες. Ωστόσο, μέχρι στιγμής, ο μόνος καθιερωμένος βιοδείκτης που χρησιμοποιείται είναι ο CA-125, ενώ υπάρχει και ο ΗΕ4, που φαίνεται να δίνει ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Η πρόγνωση των ασθενών που έχουν διαγνωσθεί με καρκίνο των ωοθηκών είναι ιδιαίτερα δυσμενής λόγω της διάγνωσης σε προχωρημένα στάδια της νόσου και λόγω της απουσίας ειδικών, ευαίσθητων μοριακών βιοδεικτών. Έτσι, αποτελεί επιτακτική ανάγκη η εύρεση νέων προγνωστικών βιοδεικτών που θα μπορούν να βοηθήσουν στην αποτελεσματικότερη διαχείριση αυτής της θανατηφόρας κακοήθειας. Η Ν6-μεθυλαδενοσίνη (m6A) είναι μία από τις επιγενετικές τροποποιήσεις του RNA, η οποία ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων, επηρεάζοντας έτσι τη μοίρα των μορίων RNA. Είναι μια αναστρέψιμη διαδικασία και ρυθμίζεται από «συγγραφείς» μεθυλτρανσφεράσης (writers). Οι μέχρι στιγμής γνωστές m6A μεθυλτρανσφεράσες, (writers) περιλαμβάνουν, μεταξύ άλλων, την METTL3, την METTL14, την WTAP, την VIRMA. Τα τελευταία χρόνια, πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι η απορρύθμιση του m6A συμπλόκου μεθυλίωσης σχετίζεται στενά με διάφορους ανθρώπινους καρκίνους και συγκεκριμένα, η αλλαγή των επιπέδων έκφρασης των m6a μεθυλτρασνφερασών έχει συσχετιστεί με διάφορους τύπους καρκίνου, όπως ο καρκίνος των ωοθηκών. Τα miRNAs αποτελούν RNA μόρια μήκους 20-22 νουκλεοτιδίων και αποτελούν αρνητικοί ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης. Η βιβλιογραφία υποστηρίζει ότι η μείωση των επιπέδων έκφρασης των miRNAs σχετίζεται με τον καρκίνο.
Η ύπαρξη βιβλιογραφίας που υποστηρίζει τη συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης των m6a μεθυλτρανσφερασών με τον καρκίνο των ωοθηκών, οδήγησε στην μελέτη τους στην παρούσα διπλωματική εργασία. Σε πρώτο στάδιο, μελετήθηκε η συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης των τεσσάρων σημαντικότερων m6a μεθυλτρανσφερασών (METTL3, METTL14, WTAP, VIRMA) σε ομάδα ασθενών με επιθηλιακού τύπου καρκίνο των ωοθηκών (ομάδα ελέγχου). Σε δεύτερη φάση, έγινε προσπάθεια μελέτης της πιθανώς σημαντικής συσχέτισης που έχουν οι m6a μεθυλτρανσφεράσες METTL3, METL14 με τα miRNAs που στοχεύουν αυτές τις δυο μεθυλτρασφεράσες, μια συσχέτιση που έχει αποδειχθεί μέσω του συστήματος της λουσιφεράσης, αλλά και μέσω βιοπληροφορικών εργαλείων που μας δίνουν την δυνατότητα να προβλέψουμε ποια πιθανά miRNAs στοχεύουν και επομένως ρυθμίζουν, τις METTL3, METTL14. Η πειραματική διαδικασία που ακολουθήσαμε είναι η εξής: Αρχικά, απομονώθηκε το ολικό RNA, και υπολογίστηκε η συγκέντρωσή του φασματοφωτομετρικά. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των m6a μεθυλτρανσφερασών έγινε αντίστροφη μεταγραφή και real time PCR, ενώ για τα miRNAs ακολουθήσαμε πολυαδενυλίωση, αντίστροφη μεταγραφή και real time PCR. Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με χρήση του SPSS.
Η ανάλυση επιβίωσης της ομάδας ελέγχου έδειξε ότι τα αυξημένα επίπεδα της μεθυλτρανσφεράσης METTL14 σχετίζονται στατιστικώς σημαντικά με τη μειωμένη ολική επιβίωση αλλά και την επιβίωση ελευθέρας εξέλιξης της νόσου των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του ΜΕΤΤL14 οδηγούν σε αύξηση του κινδύνου για μειωμένη επιβίωση και μια προδιάθεση για μείωση της ελευθέρας εξέλιξης του καρκίνου. Οι μεθυλτρανσφεράσες METTL3, WTAP, VIRMA δεν παρουσίασαν στατιστικώς σημαντική σχέση στην παρούσα διπλωματική εργασία. Επιπλέον, η ανάλυση συσχέτισης κατά Spearman - με τα διαγράμματα διασποράς -, δεν έδειξε κάποια στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των miRNAs που επιλέχθηκαν να μελετηθούν (με βάση την βιβλιογραφία και τα εργαλεία πρόβλεψης), με τις METTL3, METTL14. Tέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση συσχέτισης κατά Spearman για τις ίδιες τις m6a μεθυλτρανσφεράσες, όπου και αναδείχθηκε η ήδη επιβεβαιωμένη θετική συσχέτισή τους. Αναμφίβολα, η περαιτέρω μελέτη της απορρύθμισης των επιπέδων, τόσο των m6a μεθυλτρανσφερασών, όσο και των miRNAs που τις ρυθμίζουν, σε μελέτες μεγάλης κλίμακας με ασθενείς του καρκίνου των ωοθηκών, θα αποκαλύψει την χρησιμότητα των βιομορίων αυτών στην κλινική αντιμετώπιση των ασθενών αυτών.
(EL)
Ovarian cancer is an umbrella term to describe a number of molecularly and etiologically distinct diseases that simply share the same anatomical region. It is a gynecological malignancy that comes 2nd in diagnosis in developed countries and 1st in terms of incidence/death ratio. About 70% of patients are diagnosed in advanced stages of the disease. In recent years, patient survival has improved, with 5-year survival reaching 46%. However, the absence of an appropriate method for the early diagnosis of patients is absent, resulting in survival being still low. Ovarian cancer is often called the "silent killer" because no specific symptoms appear in the initial stages of the disease. As a result, 80% of cases with these types of symptoms are diagnosed at advanced stages. Finding new biomarkers in ovarian cancer is an extremely important process for diagnosis, patient management, finding targeted and effective treatment, categorizing patients according to their response to it as well as finding recurrent disease. Various research studies have highlighted many promising biomarkers. However, so far, the only established biomarker in use is CA-125, and there is also HE4, which appears to be showing encouraging results. The prognosis of patients diagnosed with ovarian cancer is particularly poor due to the diagnosis at advanced stages of the disease and the absence of specific, sensitive molecular biomarkers. Thus, it is imperative to find new prognostic biomarkers that can help in more effective management of this deadly malignancy. N6-methyladenosine (m6A) is one of the epigenetic modifications of RNA, which regulates gene expression, thus influencing the fate of RNA molecules. It is a reversible process and is regulated by methyltransferase "writers". The so far known m6A methyltransferases (writers) include, among others, METTL3, METTL14, WTAP, VIRMA. In recent years, many studies have demonstrated that dysregulation of the m6A methylation complex is closely related to various human cancers, and in particular, altered expression levels of m6a methyltransferases have been associated with various types of cancer, such as ovarian cancer. miRNAs are RNA molecules 20-22 nucleotides long and are negative regulators of gene expression. The literature supports that a decrease in the expression levels of miRNAs is associated with cancer.
The existence of literature supporting the correlation of the expression levels of m6a methyltransferases with ovarian cancer, led to their study in this thesis. In a first stage, the correlation of the expression levels of the four most important m6a methyltransferases (METTL3, METTL14, WTAP, VIRMA) was studied in a group of patients with epithelial ovarian cancer (control group). In a second phase, an attempt was made to study the possibly important correlation that the m6a methyltransferases METTL3, METL14 have with the miRNAs that target these two methyltransferases, a correlation that has been demonstrated through the luciferase system, but also through bioinformatic tools that allow us to predict which potential miRNAs target, and thus regulate, METTL3, METTL14. The experimental procedure we followed is as follows: First, total RNA was isolated, and its concentration was calculated spectrophotometrically. For the quantitative determination of m6a methyltransferases, reverse transcription and real time PCR were performed, while for miRNAs we followed polyadenylation, reverse transcription and real time PCR. The results were processed using SPSS.
Survival analysis of the control group showed that increased levels of methyltransferase METTL14 were statistically significantly associated with reduced overall survival and progression-free survival of ovarian cancer patients. In addition, elevated levels of METTL14 expression lead to an increased risk of reduced survival and a predisposition to reduced cancer free progression. The methyltransferases METTL3, WTAP, VIRMA did not present a statistically significant relationship in this thesis. Moreover, the Spearman correlation analysis - with the scatter plots -, did not show any statistically significant correlation between the expression levels of the miRNAs chosen to be studied (based on the literature and prediction tools), with METTL3, METTL14. Finally, a Spearman correlation analysis was performed for the m6a methyltransferases themselves, where their already confirmed positive correlation was highlighted. Undoubtedly, the further study of the deregulation of the levels, both of m6a methyltransferases and the miRNAs that regulate them, in large-scale studies with ovarian cancer patients, will reveal the utility of these biomolecules in the clinical management of these patients.
(EN)
University of Athens
