Το οξειδωτικό στρες ορίζετε ως η ανισορροπία μεταξύ της παραγωγής ενεργών ειδών οξυγόνου και της αντιοξειδωτικής άμυνας και συμβάλλει σημαντικά σε διάφορες παθοφυσιολογικές διεργασίες. Η κυτταρική απόκριση στο στρες περιλαμβάνει μια μάχη μεταξύ επιβίωσης ή κυτταρικού θανάτου όταν η βλάβη είναι σοβαρή. Οι ριβονουκλεάσες είναι βασικά ένζυμα που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του RNA, ένα από τα κρίσιμα βήματα στον έλεγχο της έκφρασης των γονιδίων και ως εκ τούτου στον έλεγχο της μοίρας των κυττάρων. Διάφορες μελέτες έχουν επισημάνει τον ρόλο αυτών των ενζύμων σε στρεσογόνες καταστάσεις, όπου ρυθμίζουν την κυτταρική απόκριση μέσω της αποικοδόμησης ορισμένων ειδών RNA. Η ριβονουκλεάση Κ ανήκει στην κατηγορία των ενδοριβονουκλεασών και σε επίπεδο mRNA εκφράζεται σε όλους τους ιστούς και σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια. Η RNASEK εντοπίζεται στην κυτταρική επιφάνεια και στα ενδοσώματα, ενώ ο βιολογικός του ρόλος είναι ακόμα άγνωστος, φαίνεται να συμμετέχει στη λειτουργία της αντλίας πρωτονίων (V-ATPase), στην ενδοκυττάρωση των ιών, στην παραγωγή piwi-RNAs ενώ επίσης εμπλέκεται στη διαδικασία της απόπτωσης και είναι ένας πιθανός καρκινικός βιοδείκτης.
Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής είναι να μελετήσει τα επίπεδα έκφρασης του εναλλακτικού μεταγράφου 14 του γονιδίου RNASEK σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές υπό την επίδραση οξειδωτικών παραγόντων. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα HEK293T, MCF7 και HTB9 καλλιεργήθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις H2O2 και του αναστολέα πρωτεασώματος, Carfilzomib (CFZ) για διάφορες περιόδους επώασης και τα ποσοστά κυτταροτοξικότητας και απόπτωσης προσδιορίστηκαν με την τεχνική αποκλεισμού Trypan Blue και τη δοκιμή διφαινυλαμίνης, αντίστοιχα. Μετά την επιβεβαίωση της επαγωγής κυτταρικού και αποπτωτικού θανάτου από οξειδωτικό στρες, η έκφραση των μεταγραφών μελετήθηκε με αντιδράσεις σε πραγματικό χρόνο qPCR, χρησιμοποιώντας φθορίζουσα χρωστική SYBR Green I, μετά από απομόνωση RNA και δημιουργία cDNA από 160 δείγματα κυττάρων. Τα αποτελέσματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε στατιστική επεξεργασία για να συσχετιστούν τα επίπεδα έκφρασης με παράγοντες. Τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης δείχνουν ότι τα επίπεδα έκφρασης του μεταγραφήματος 14 αυξάνονται (8-15 φορές) σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις για τις περιόδους επώασης H2O2 16, 24 και 48 ωρών. Το γεγονός ότι το αντίγραφο 14 έχει χαμηλά επίπεδα έκφρασης υπό κανονικές συνθήκες, η αύξησή του υπό την επίδραση οξειδωτικού στρες, που οδηγεί το κύτταρο σε νεκρωτικό ή/και αποπτωτικό θάνατο, υποδηλώνει τη συμμετοχή του σε αυτές τις διαδικασίες. Συμπερασματικά, φαίνεται ότι η διαδικασία του εναλλακτικού ματίσματος παράγει μεταγραφές ενός γονιδίου με διαφορετικές ιδιότητες, που μπορεί να είναι κωδικοποιημένες ή όχι και να παίζουν σημαντικούς ρόλους στη λειτουργία των κυττάρων, που αξίζει να χαρακτηριστούν.
(EL)
Oxidative stress has been defined as the imbalance between the production of active oxygen species and the antioxidant defense and contributes significantly to various pathophysiological processes. The cellular response to stress involves a decision between survival or cell death when the damage is severe. Ribonucleases are key enzymes involved in RNA metabolism, one of the crucial steps in controlling gene expression and therefore in controlling cell fate. Various studies have highlighted the role of these enzymes in stressful situations, where they regulate cell responses through the degradation of certain cellular RNA species. Ribonuclease κ belongs to the class of endoribonucleases and at the mRNA level is expressed in all tissues and at all developmental stages. RNASEK is located on the cell surface and endosomes, while its biological role is still unknown, it seems to take part in the operation of the proton pump (V-ATPase), the endocytosis of viruses, the production of piwi-RNAs, also is involved in the process of apoptosis and is a potential cancer biomarker.
The aim of this master thesis is to study the expression levels of the alternative transcript 14 of RNASEK gene in a human cell lines under the influence of oxidizing agents. For this purpose, HEK293T, MCF7 and HTB9 cells were cultured at increasing concentrations of H2O2 and the proteasome inhibitor, Carfilzomib (CFZ) for various incubation periods and the rates of cytotoxicity and apoptosis were determined by the Trypan Blue exclusion technique and the diphenylamine test, respectively. After confirmation of induction of cellular and apoptotic death by oxidative stress, the expression of transcripts was studied by Real Time qPCR reactions, using fluorescent dye SYBR Green I, after RNA isolation and cDNA generation from 160 cell samples. The results were then statistically processed to correlate expression levels with factors. The results of statistical analysis show that expression levels of transcript 14 are increased (8-10 times) at specific concentrations for the 16, 24 and 48 h H2O2 incubation periods. The fact that transcript 14 has low levels of expression under normal conditions, the increase of it under the influence of oxidative stress, which leads the cell to necrotic and / or apoptotic death, indicates its involvement in these processes. In conclusion, it seems that the process of alternative splicing produces transcripts of a gene with different properties, which may or may not be coded and play important roles in cell function, which are worth characterizing.
(EN)
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
