Εισαγωγή
Η Συγγενής Υπερπλασία των Επινεφριδίων (ΣΥΕ) αποτελεί μια ομάδα διαταραχών που κληρονομούνται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο και προκαλούνται από έλλειψη ενός από τα ένζυμα του μονοπατιού της στεροειδογένεσης και συγκεκριμένα της σύνθεσης κορτιζόλης στο φλοιό των επινεφριδίων. Η έλλειψη του ενζύμου 21-υδροξυλάσης είναι η συχνότερη αιτία ΣΥΕ. Το ένζυμο 21 υδροξυλάση κωδικοποιείται από το γονίδιο CYP21A2 και παθογόνες παραλλαγές του οποίου οδηγούν σε έλλειψη του ενζύμου και ΣΥΕ. Η παρουσία του ψευδογονιδίου CYP21A1P γειτονικά στο γονίδιο CYP21A2 και η υψηλή ομολογία που αυτά εμφανίζουν μεταξύ τους, αποτελεί εμπόδιο στην ταυτοποίηση παθογόνων παραλλαγών. Το CYP21A1P φέρει πολλές παθογόνες παραλλαγές, οι οποίες λόγω της κοντινής απόστασής του με το λειτουργικό γονίδιο μεταφέρονται σε αυτό. Το γεγονός αυτό αποτελεί εμπόδιο στην ανάλυση του CYP21A2 με τη μεθοδολογία Αλληλούχισης επόμενης γενιάς (NGS), η οποία αναγνωρίζει ταυτόχρονα παραλλαγές του CYP21A2 και του CYP21A1P, χωρίς τη δυνατότητα διάκρισής τους. Έτσι, παθογόνες παραλλαγές που εντοπίζει η NGS μπορεί να βρίσκονται στο ψευδογονίδιο και εσφαλμένα να αποδίδονται στο λειτουργικό γονίδιο, οδηγώντας σε ψευδώς θετικό αποτέλεσμα και λανθασμένη διάγνωση.
Υλικό και Μέθοδοι
Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν παραλλαγές του γονιδίου CYP21A2 που προέκυψαν ως τυχαία ευρήματα από Exome Sequencing (ES). Τα 29 δείγματα DNA εξετάσθηκαν για 6 ομάδες παθογόνων παραλλαγών που αναγνωρίστηκαν από το ES. Πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση κατά Sanger, προκειμένου να διευκρινιστεί η προέλευση των παραλλαγών από το γονίδιο ή το ψευδογονίδιο. Με τη βασιζόμενη σε PCR αλληλούχιση κατά Sanger επιτυγχάνεται επιλεκτικός πολλαπλασιασμός τμημάτων ολόκληρου του γονιδίου CYP21A2 με ειδικούς εκκινητές. Οι εκκινητές αυτοί βασίζονται σε 8 νουκλεοτίδια του εξονίου 3, τα οποία είναι παρόντα στο λειτουργικό γονίδιο, αλλά απουσιάζουν από το ψευδογονίδιο.
Αποτελέσματα
Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι τα τυχαία ευρήματα του Exome Sequencing δεν ήταν όλα αληθώς θετικά. Από τα 29 δείγματα DNA που μελετήθηκαν στα 14 διαπιστώθηκε με αλληλούχιση κατά Sanger πως τα τυχαία ευρήματα ήταν ψευδώς θετικά καθώς δε βρέθηκαν στο CYP21A2. Στα υπόλοιπα 13 δείγματα επιβεβαιώθηκε η παρουσία της παθογόνου παραλλαγής σε ετεροζυγωτία, σε 1 δείγμα ταυτοποιήθηκε σε ομοζυγωτία και 1 δείγμα βρέθηκε να φέρει τρία αλληλόμορφα του γονιδίου.
Συμπεράσματα
Τα τελευταία χρόνια η μεθοδολογία Αλληλούχισης Νέας Γενιάς αρχίζει να αντικαθιστά την αλληλούχιση κατά Sanger, ωστόσο δεν ενδείκνυται ως μέθοδος επιλογής για την αλληλούχιση του γονιδίου CYP21A2, λόγω της υψηλής ομολογίας CYP21A1P –CYP21A2. Η εξέλιξη των μεθοδολογιών αλληλούχισης επόμενης γενιάς και της επεξεργασίας των αποτελεσμάτων επιτρέπει νέες εφαρμογές της αλληλούχισης τρίτης γενιάς, όπως η αλληλούχιση μεγαλύτερων τμημάτων DNA με τη δυνατότητα ανίχνευσης ελλείψεων, διπλασιασμών και μετατροπών. Το μέλλον της γενετικής ανάλυσης και της διάγνωσης, βασίζεται στην περαιτέρω εξέλιξη των τεχνολογιών NGS και της βιοπληροφορικής, οι οποίες προσφέρουν δυνατότητες διαχείρισης μεγαλύτερου όγκου δειγμάτων και αποτελεσμάτων.
(EL)
Introduction
Congenital adrenal hyperplasia (CAH) refers to a group of autosomal recessive disorders caused by defects in one of the several steroidogenic enzymes involved in the conversion of cholesterol to cortisol in the adrenal cortex. 21-hydroxylase deficiency represents the most common form of CAH. The enzyme of 21-hydroxylase is encoded by the CYP21A2 gene and pathogenic variants occurring in it lead to 21-hydroxylase deficiency. The presence of CYP21A1P pseudogene neighboring CYP21A2 and the high degree of homology between them complicates the identification of pathogenic variants. CYP21A1P as a pseudogene contains variants which can be transferred to CYP21A2 due to their proximity. Thus the application of Next Generation Sequencing methodology is not recommended for sequencing of CYP21A2, as NGS identifies pathogenic variants on both CYP21A1P and CYP21A2 simultaneously without the ability to discriminate their origin. In this way, pathogenic variants of CYP21A1P are detected by NGS and can be inaccurately assumed to be present in CYP21A2 gene, leading to false positive results and incorrect diagnosis.
Materials and Methods
This study was performed on CYP21A2 variants which were identified as incidental findings in Exome Sequencing. The 29 DNA samples of the study were analyzed for 6 groups of pathogenic variants, that were identified by ES. Sanger sequencing was performed in order to discriminate the location of each variant in the gene or the pseudogene. PCR-based Sanger sequencing using primers to cover the whole CYP21A2 gene can selectively amplify only the active gene. These primers are specific for 8 bps deletion in exon 3, which exist in CYP21A2, but are missing in CYP21A1P.
Results
The results confirmed that not all of the incidental findings of Exome Sequencing were true positive. 14 of 29 samples analyzed with Sanger sequencing were found to be false positive for the pathogenic variant, as they were not present in the CYP21A2 gene. The remaining 13 samples were confirmed with the presence of the pathogenic variant in heterozygosity, 1 in homozygosity and 1 sample was found with 3 copies of CYP21A2.
Conclusions
To date, Next Generation Sequencing (NGS) has replaced Sanger Sequencing, although it is not recommended as the method of choice for CYP21A2 genotyping, due to the high homology of CYP21A1P/CYP21A2. The evolution of next-generation sequencing methodologies and bioinformatics enables new applications, such as Long-Read Sequencing, which can identify not only single nucleotide variants, but also deletions, duplications and gene conversions. The future of genetic analysis and diagnosis depends on the improvement of NGS technologies and bioinformatics which offer possibilities to manage larger volume of samples and results.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
