Στις μέρες μας, το ζήτημα της εξάντλησης των μη ανανεώσιμων φυσικών πόρων και η μόλυνση του περιβάλλοντος από πλαστικό αποτελούν σοβαρά και καίρια ζητήματα για την παγκόσμια κοινότητα. Προτείνονται πλέον όλο και νεότερες στρατηγικές διαχείρισης των πλαστικών ρύπων και επαναχρησιμοποίησης των επιμέρους συστατικών τους, με σημαντική την συμβολή των μικροοργανισμών και των μεταβολικών τους προϊόντων. Ταυτόχρονα, αναζητούνται πλέον από ακαδημαϊκούς, αλλά και βιομηχανικούς φορείς νέοι τρόποι αξιοποίησης των παραπροϊόντων των αγροτικών βιομηχανιών, με σκοπό την εκμετάλλευση ανανεώσιμων πηγών όπως είναι η φυτική βιομάζα για την παραγωγή υλικών, χημικών ενώσεων και φαρμακευτικών σκευασμάτων.
Στον ερευνητικό τομέα, ο κλάδος της βιοτεχνολογίας ασχολείται σε μεγάλο βαθμό με την μελέτη και βελτιστοποίηση ενζύμων, με στόχο την κατασκευή βιοκαταλυτικών συστημάτων που δύνανται να συμβάλλουν σε τέτοιες βιομηχανικές διαδικασίες. Η παρούσα μελέτη διερευνά την ενεργότητα της φερουλικής εστεράσης FoFaeC από τον μύκητα Fusarium oxysporum και τις σημειακές μεταλλαγές του ενζύμου: G122S, T202E, G122S/I415F, T202E/I415F, G122S/T2023 και G122S/T202E/I415F, που κατασκευάστηκαν και μελετήθηκαν στο παρελθόν με στόχο την αύξηση της συγγένειας του ενζύμου στο μονομερές του PET, το MHET.
Στο πειραματικό κομμάτι της παρούσας διπλωματικής εργασίας, το φυσικού τύπου ένζυμο και τα λοιπά μεταλλάγματα εκφράστηκαν στο ετερόλογο σύστημα της P. pastoris X33 και πάρθηκε τελικά ένα ακατέργαστο εκχύλισμα των εκκρινόμενων μεταβολικών προϊόντων της ζύμης, μέσα στο οποίο περιεχόταν και το ένζυμο ενδιαφέροντος. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η δράση τους στο απλό τεχνητό υπόστρωμα mFA, αλλά και σε ένα φυσικό υπόστρωμα, το πίτυρο σίτου, που αποτελεί και αυτό έναν άφθονο ανανεώσιμο πόρο, από τον οποίο μπορούν να εξαχθούν υψηλής προστιθέμενης αξίας ενώσεις. Μια τέτοια είναι και το φερουλικό οξύ, του οποίου την απελευθέρωση καταλύει η FoFaeC, διασπώντας τους εστερικούς δεσμούς μεταξύ αυτού και της αραβινοξυλάνης.
Όσον αφορά το υπόστρωμα mFA, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε αυτό έδρασαν αποτελεσματικότερα η WT, η G122S, η T202E, αλλά και η G122S/T202E, ενώ η WT πρωτεΐνη εμφάνισε την μέγιστη ενεργότητα. Η FoFaeC G122S πλησίασε περισσότερο τις τιμές της WT, με την G122S/T202E και την T202E να ακολουθούν. Το φυσικού τύπου ένζυμο και οι παραλλαγές του, φάνηκε να έχουν ανάλογη συγκριτική δράση με αυτή της προαναφερθείσας αντίδρασης όσον αφορά τις ενζυμικές αντιδράσεις με το φυσικό υπόστρωμα, όπου μετρήθηκε η απελευθέρωση φερουλικού οξέος στην 1h και στις 4h επώασης. Στη συγκεκριμένη περίπτωση βέβαια παρατηρήθηκε μείωση του ρυθμού δράσης στις 4h και για αυτό κρίνεται απαραίτητη η μελλοντική διερεύνηση των κινητικών παραμέτρων, ώστε να γίνει ακριβής ποσοτικοποίηση της ειδικής ενεργότητας εντός της γραμμικής περιοχής δράσης του ενζύμου. Επίσης, η ποσότητα του απελευθερωμένου φερουλικού οξέος ήταν σχετικά υψηλή σε όλα τα δείγματα, με νούμερα συγκρίσιμα και σε ορισμένες περιπτώσεις υψηλότερα σε σχέση με άλλες μελέτες στην βιβλιογραφία.
Αξιοπρόσεκτο είναι το γεγονός ότι κοινό στοιχείο των συγκριτικά λιγότερο ενεργών μεταλλαγμάτων αποτελεί η σημειακή αλλαγή I415F. Πιθανώς το κατάλοιπο φαινυλαλανίνη παρεμποδίζει την είσοδο του υποστρώματος στο ενεργό κέντρο, καθιστώντας την υδρόφοβη περιοχή του στενότερη και λιγότερο προσβάσιμη, οδηγώντας στη μείωση της συγγένειας του ενζύμου στο υπόστρωμα. Επιπλέον, η αντικατάσταση του καταλοίπου θρεονίνη από γλουταμικό οξύ στην θέση 202 θα έπρεπε να βελτιώσει την δομή της οπής οξυανιόντος και άρα αυξημένη καταλυτική δράση στο υπόστρωμα MHET. Πειραματικά, στα εξεταζόμενα υποστρώματα φάνηκε ότι η μεταλλαγή αυτή οδήγησε στη μείωση της ενζυμικής δράσης. Τέλος, η τροποποίηση του καταλοίπου 122 από γλυκίνη σε σερίνη επίσης δημιουργήθηκε με την λογική της δημιουργίας μιας βελτιστοποιημένης οπής οξυανιόντος. Σε αυτή την περίπτωση, παρατηρήθηκε αυξημένη απελευθέρωση φερουλικού οξέος μόνο στις 4h επώασης της αντίδρασης στο υπόστρωμα DSWB. Βέβαια, οι μεταλλαγές σχεδιάστηκαν για την αύξηση της δράσης της FoFaeC στο MHET, που διαφέρει από τα υποστρώματα που εξετάζονται στην παρούσα διπλωματική εργασία.
Ακόμα, η προσθήκη του ενζύμου ξυλανάση στην αντίδραση με το φυσικό υπόστρωμα είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της απόδοσης των ενζύμων, γεγονός αναμενόμενο λόγω της συνεργιστικής δράσης ξυλανασών και φερουλικών εστερασών στην υδρόλυση της ημικυτταρίνης. Αυτό φάνηκε και στα αποτελέσματα της δοκιμασίας DNS, στην οποία παρατηρήθηκε υψηλότερη συγκέντρωση των μετρήσιμων αναγωγικών σακχάρων όταν είχε προστεθεί στο δείγμα ξυλανάση.
Συμπερασματικά, η WT FoFaeC και οι μεταλλάξεις G122S, G122S/T2023 και T202E είχαν αξιοσημείωτη ενεργότητα στην υδρόλυση των εστερικών δεσμών μεταξύ φερουλικού οξέος και αραβινοξυλάνης. Το συμπέρασμα αυτό έρχεται σε αντίθεση με προηγούμενη μελέτη, στην οποία το WT ένζυμο και οι προαναφερθείσες μεταλλαγές εξετάστηκαν ως προς την ενεργότητα στο MHET. Είχε διαπιστωθεί ότι μόνο το μετάλλαγμα G122S και η WT δρουν στο εν λόγω υπόστρωμα, με το πρώτο να παρουσιάζει υψηλότερη δράση σε σχέση με την WT. Όλα τα παραπάνω αποτελούν μια ένδειξη της υψηλής εξειδίκευσης του ενζύμου, το οποίο δρα διαφορετικά στο κάθε υπόστρωμα. Βέβαια, το ένζυμο και τα εξεταζόμενα μεταλλάγματα χρήζουν περαιτέρω μελέτης, κυρίως ως προς την βελτιστοποίηση της διαδικασίας καθαρισμού τους, αλλά και του προσδιορισμού των κινητικών παραμέτρων, ώστε να εξαχθούν ακριβέστερα συμπεράσματα.
(EL)
Nowadays, the issues of non-renewable natural resource depletion and environmental pollution from plastic waste are serious and crucial matters for the global community. Many new innovative strategies are being proposed for managing plastic waste and reusing its individual components, with the contribution of microorganisms and their metabolic products. Additionally, researchers, both in academia and industry, are now exploring novel ways to utilize byproducts from agricultural industries, aiming to harness renewable sources such as plant biomass, for material and packaging production, chemical compounds, and pharmaceutical products.
The field of biotechnology is heavily involved in studying and optimizing enzymes and in many cases the main goal is to create biocatalytic systems that can contribute to such industrial processes as the previously mentioned ones. This study examines the ferulic acid esterase FoFaeC from the fungus Fusarium oxysporum and six mutants (G122S, T202E, G122S/I415F, T202E/I415F, G122S/T2023, G122S/T202E/I415F). These mutations were initially designed and studied aiming to enhance the enzyme’s affinity towards the monomer of PET (MHET), which is one of the most widely used plastic polymers. The enzyme has been extensively studied in recent years, with its crystalline structure resolved. Also, its key amino acids contributing to structural stability and proper catalytic action have been unraveled to a significant extent.
In the experimental part of this thesis, the wild-type enzyme and its mutants were expressed in the heterologous system of P. pastoris X33, resulting in a crude extract of the yeast's secreted metabolic products, which included the enzyme of interest. Subsequently, their activity was investigated on the simple artificial substrate mFA and a natural substrate, wheat bran, which is also an abundant renewable resource from which high-value compounds can be extracted. One such compound is ferulic acid, whose release is catalyzed by FoFaeC by breaking the ester bonds between it and arabinoxylan.
Regarding the mFA substrate, the results showed that WT, G122S, T202E, and G122S/T202E acted most effectively on it, with the WT protein exhibiting the highest activity. The FoFaeC G122S mutation closely matched the WT values, followed by G122S/T202E and T202E. The enzymes displayed also similar comparative activity in the case of the natural substrate reactions, where ferulic acid release was measured at 1h and 4h of incubation. A decrease in activity rate was noted at 4h, indicating a need for further investigation of the kinetic parameters to precisely quantify specific activity within the enzyme's linear range. The amount of released ferulic acid was relatively high in all samples, with numbers comparable to or exceeding those in other studies.
Interestingly, a common feature of the less active mutants was the point mutation I415F. It is likely that the phenylalanine residue obstructs substrate entry to the active site, making the hydrophobic area narrower and less accessible, reducing enzyme-substrate affinity. Additionally, replacing threonine with glutamic acid at position 202 was expected to improve the structure of the oxyanion hole and increase enzymatic activity towards MHET. Experimentally, this mutation decreased enzymatic activity towards the studied substrates. The modification of residue 122 from glycine to serine also aimed to optimize the oxyanion hole. In this case, increased release of FA was only observed for DSWB substrate, after 4h of incubation of the enzymatic reaction. However, these mutations were designed to enhance FoFaeC's activity on MHET, which differs from the substrates examined in this thesis.
Moreover, adding xylanase to the reaction with the natural substrate increased enzyme efficiency, which was expected due to the synergistic action of xylanases and feruloyl esterases in hemicellulose hydrolysis. This was evident in the DNS assay results, showing higher concentrations of measurable reducing sugars when xylanase was added.
In conclusion, WT FoFaeC and the mutations G122S, G122S/T202E and T202E exhibited significant activity in hydrolyzing the ester bonds between ferulic acid and arabinoxylan. This contrasts with a previous study where WT and these mutations were tested on MHET, revealing that only G122S and WT were active on it, with G122S showing higher activity than WT. These findings highlight the enzyme's high specificity, acting differently on each substrate. Further studies are needed to optimize the purification process of the enzyme and determine kinetic parameters for more accurate conclusions.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
