Οι λοιμώξεις από παθογόνους μικροοργανισμούς αποτελούν συνεχή και σημαντική
πρόκληση σε διάφορους τομείς που σχετίζονται, για παράδειγμα, με τα συστήματα καθαρισμού
του νερού, τη συσκευασία τροφίμων, τα συνθετικά κλωστοϋφαντουργικά προϊόντα, τις
κατασκευές, την υγειονομική και ιατρική περίθαλψη, την οικιακή υγιεινή κ.α., καθώς οι
βακτηριακές λοιμώξεις είναι γνωστό ότι αποτελούν μία από τις κυριότερες αιτίες θανάτου των
ανθρώπων παγκοσμίως. Μέχρι σήμερα, η χρήση αντιβιοτικών αποτελεί το κυριότερο όπλο
στην καταπολέμηση μολυσματικών ασθενειών, αλλά λόγω της κακής και εκτεταμένης χρήσης
τους, η αντοχή στα αντιβιοτικά (Μικροβιακή Αντοχή) έχει καταστεί μία από τις κορυφαίες
απειλές για τη δημόσια υγεία του 21ου αιώνα. Από την άλλη, διάφορα απολυμαντικά, όπως
υποχλωριώδη, τρικλοζάνη, υπεροξείδιο του υδρογόνου, άλατα αργύρου κ.λπ.,
χρησιμοποιούνται στην καθημερινή ζωή για την καταπολέμηση της μικροβιακής μόλυνσης,
αλλά εξαιτίας της μικρής διάρκειας ζωής τους και διάφορων θεμάτων ασφάλειας, που
σχετίζονται με την υγεία, η χρήση τους είναι περιορισμένη. Έτσι, στη σύγχρονη εποχή και
ιδιαίτερα μετά την πανδημία του Covid-19, η ανάγκη για το σχεδιασμό νέων αντιμικροβιακών
υλικών για την καταπολέμηση των μικροβιακών λοιμώξεων, είναι πλέον επιτακτική.
Στην παρούσα διπλωματική εργασία αναπτύχθηκαν νέα αντιβακτηριδιακά υλικά με
βάση νανοσωλήνες αλλοϋσίτη (HNTs-Halloysite Nanotubes), ένα αργιλοπυριτικό ορυκτό της
ομάδας των καολινιτών με χημική δομή Al2Si2O5(OH)4·nH2O. Οι νανοσωλήνες αλλοϋσίτη
φέρουν κυρίως ομάδες οξειδίου του αργιλίου (Al2O3) στο εσωτερικό τους και ομάδες οξειδίου
του πυριτίου (SiO2) στην εξωτερική τους επιφάνεια, με αποτέλεσμα αυτές οι επιφάνειες να είναι
αντίθετα φορτισμένες. Η συγκεκριμένη μορφολογία, καθώς και η χημική δομή, καθιστά τους
HNTs ιδανικούς υποψήφιους για την εναπόθεση μεγάλης ποικιλίας μορίων, τόσο στην
εσωτερική κοιλότητα των νανοσωλήνων, όσο και στην εξωτερική τους επιφάνεια.
Η συγκεκριμένη εργασία επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη τροποποιημένων
νανοσωλήνων αλλοϋσίτη με ομάδες πολυ(αιθυλενογλυκόλης) (PEG), οι οποίες στο τελικό άκρο
τους τροποποιήθηκαν με κατάλληλες ομάδες, που είναι γνωστό ότι επάγουν αντιβακτηριδιακές
ιδιότητες. Σκοπός ήταν να ενισχυθούν οι αντιβακτηριδιακές ιδιότητες των HNTs, αλλά και
αφενός να μειωθεί η κυτταροτοξικότητα και αφετέρου να αυξηθεί η υδροφιλικότητα τους και
άρα η συμβατότητα με διάφορα υδατικά μέσα. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε είναι η εξής:
αρχικά με χρήση υπερήχων και διαδοχικών φυγοκεντρίσεων πραγματοποιήθηκε καθαρισμός
των εμπορικά διαθέσιμων νανοσωλήνων HNTs και διαχωρισμός των μικρών σε μήκος από
τους μεγαλύτερους, καθώς οι μικρότεροι σε μήκος νανοσωλήνες θεωρούνται, βάσει
βιβλιογραφίας, καταλληλότεροι για βιολογικές εφαρμογές. Στη συνέχεια, αφού
πραγματοποιήθηκε ενεργοποίηση των HNTs σε αλκαλικό περιβάλλον και εισαγωγή
λειτουργικών ομάδων (αμινομάδων και καρβοξυλομάδων) στην επιφάνειά τους, ακολούθησε
τροποποίηση τους, με μία σειρά αντιδράσεων, χρησιμοποιώντας τρία παράγωγα της
πολυ(αιθυλενογλυκόλης) (PEG), με στόχο να μειωθεί η κυτταροτοξικότητα των HNTs και να
βελτιωθεί η ικανότητα διασποράς τους σε υδατικά μέσα. Για τον σκοπό αυτό συντέθηκαν τρία
παράγωγα PEG, μοριακού βάρους 3000Da, που στην μία τους άκρη εισήχθησαν διαφορετικές
λειτουργικές ομάδες, οι οποίες είναι γνωστό ότι επάγουν αντιβακτηριδιακές ιδιότητες.
Συγκεκριμένα, τα λειτουργικά παράγωγα PEG που παρασκευάστηκαν έφεραν στο ένα άκρο
τους την ομάδα του τεταρτοταγούς αμμωνιακού άλατος (QAC) ή την ομάδα της σουλφο
βεταΐνης ή την ομάδα του τριφαινυλοφωσφονίου (TPP), τα οποία στη συνέχεια αντέδρασαν με
τις δραστικές ομάδες της επιφάνειας των HNTs δίνοντας τα υβριδικά υλικά HNTs-PEGQ, HNTs
PEGS και HNTs-PEGTPP, αντίστοιχα, με δύο διαφορετικούς βαθμούς υποκατάστασης.
Τα υβριδικά υλικά των τροποποιημένων νανοσωλήνων αλλοϋσίτη χαρακτηρίστηκαν,
αρχικά, φυσικοχημικά με διάφορες τεχνικές. Πιο συγκεκριμένα, η δομή των νανοσωλήνων
μελετήθηκε με φασματοσκοπία FT-IR και Περίθλαση Ακτίνων Χ (XRD), όπου και
πιστοποιήθηκε η επιτυχής αντίδραση των HNTs με τα λειτουργικά παράγωγα PEG, ενώ ο
βαθμός της υποκατάστασης των τριών παραγώγων PEG σε αυτούς υπολογίστηκε με τον
προσδιορισμό των αμινομάδων με τη μέθοδο της νινυδρίνης και με Θερμοσταθμική Ανάλυση
(TGA). Στη συνέχεια, η μορφολογία, τόσο των αρχικών, όσο και των τροποποιημένων
νανοσωλήνων, μελετήθηκε με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) και Ηλεκτρονική
Μικροσκοπία Διέλευσης (ΤΕΜ), ενώ πραγματοποιήθηκε επίσης και χαρτογράφηση των
στοιχείων τους, όπου επιβεβαιώθηκε η παρουσία των PEG στα τελικά υβριδικά υλικά. Η
σταθερότητα των υδατικών τους διασπορών αξιολογήθηκε οπτικά, αλλά και με μετρήσεις ζ
δυναμικού, όπου βρέθηκε ότι παραμένουν σταθερές για τουλάχιστον 2 μήνες, εξαιτίας της
παρουσίας, αφενός των αλυσίδων PEG και αφετέρου των φορτισμένων λειτουργικών ομάδων,
οι οποίες προσδίδουν υδροφιλικότητα στους υβριδικούς νανοσωλήνες αλλοϋσίτη. Ακολούθησε
αντιβακτηριδιακή μελέτη των υβριδικών υλικών σε κατά Gram (-) Escherichia coli και κατά
Gram (+) Staphylococcus aureus βακτήρια.
Από τα αποτελέσματα που ελήφθησαν, συμπεραίνεται ότι τα υβριδικά υλικά HNTs
PEGQ και HNTs-PEGS έχουν συγκρίσιμη αντιβακτηριδιακή δράση με τα αρχικά HNTs, ενώ τα
HNTs-PEGTPP εμφανίζουν σημαντικά βελτιωμένες αντιβακτηριδιακές ιδιότητες, ιδιαίτερα
έναντι των κατά Gram (-) E. coli βακτηρίων. Τέλος, η μελέτη της τοξικότητας των υβριδικών
υλικών έδειξε ότι σε συγκεντρώσεις όπου εμφανίζουν αντιβακτηριδιακή δράση δεν
επιδεικνύουν καμία τοξικότητα έναντι δύο επιλεγμένων ευκαρυωτικών κυτταρικών σειρών.
Συνεπώς, τα υβριδικά υλικά HNTs-PEGTPP είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν σε εφαρμογές
ως ασφαλή, αντιβακτηριδιακά υλικά, εφόσον παρουσιάζουν ταυτόχρονα, τόσο χαμηλή
κυτταροτοξικότητα, όσο και ενισχυμένες αντιβακτηριδιακές ιδιότητες.
(EL)
Pathogenic microorganisms’ infections constitute an ongoing and significant challenge
for various sectors related to, for example, water purification systems, food packaging,
synthetic textiles, constructions, healthcare and medical care, household sanitation, etc., as
bacterial infections worldwide are known to kill more people than any other cause. Up to now,
the use of antibiotics is the main weapon in the fight against infectious diseases but, due to
their misuse and overuse, antibiotic resistance becomes as one of the leading public health
threats of the 21st century. On the other hand, various disinfectants such as hypochlorite,
triclosan, hydrogen peroxide, silver salts, etc., are used in daily life to fight against microbial
contamination, but due to their short shelf life and various health-related safety issues, their
usage is restrained. Thus, nowadays, especially after the Covid-19 pandemic, there is an
urgent need to discover new antimicrobial agents to fight microbial infections.
In this study, new antibacterial agents were developed based on halloysite nanotubes
(HNTs). Halloysite nanotubes are a type of alumino-silicate clay (Al2(OH)4Si2O5*2H2O), having
the same chemistry as kaolinite but instead of the flat sheets typical of kaolinite, the sheets
have been rolled up under favourable geological conditions to form ultra thin hollow cylinders.
Chemically, HNTs are consisting of siloxane groups on the external surface and aluminol
groups in the inner lumen. The specific morphology as well as the chemical structure makes
HNTs ideal candidates for physical or chemical modification with a variety of functional groups,
either at their inner cavity or their outer surface, affording novel materials to be used in several
fields, including biomedicine, environmental science and catalysis.
This work is focused on the development of functionalized halloysite nanotubes with
polyethylene glycol (PEG) groups having various antibacterial groups at their distal end. The
aim of this work was not only to enhance the antibacterial properties of HNTs, but also to
reduce their cytotoxicity as well as to increase their hydrophilicity, and thus their dispersibility
in various aqueous media. In this concept, the commercially available halloysite nanotubes
were initially purified and shortened, using treatment with ultrasound followed by sequential
centrifugations, as it is known that the shortened nanotubes can be considered more suitable
for biological applications. The shortened HNTs were activated in alkaline environment and
then selected functional groups (amino or carboxylate) were introduced at their external
surface. Subsequently, these functionalized HNTs were modified with three different
derivatives of poly(ethylene glycol) (PEG) in order to reduce the HNTs cytotoxicity and also to
improve their dispersibility in aqueous media. For this purpose, suitable antibacterial groups,
i.e. quaternary ammonium, sulfobetaine, and triphenylphosphonium groups, were introduced
to the distal end of PEG, having a molecular weight of 3000Da, which subsequently interacted
with the amino- or carboxyl- functionalized ΗΝΤs, affording the hybrids HNTs-PEGQ, HNTs
PEGS και HNTs-PEGTPP, respectively, at two different functionalization degrees.
The obtained hybrid materials were structurally characterized using FTIR and XRD,
revealing the successful PEGylation of HNTs, while their functionalization degrees were
calculated by TGA and by using the ninhydrin assay. The morphology of the PEGylated HNTs
were studied by SEM and TEM confirming that the tubular shape of HNTs remained intact after
the functionalization, while the presence of a uniform PEG shell on the sidewalls of HNTs was
proved by STEM imaging as evident by the corresponding energy-dispersive X-ray (EDX)
mapping images. Moreover, as concluded by visual observation over time and ζ-potential
measurements, these hybrid systems can be efficiently dispersed in aqueous media, affording
stable aqueous dispersions for at least 2 months. The enhanced dispersion properties are
attributed to the presence of PEG on the surface of HNTs that induces hydrophilicity and also to the charged antibacterial groups that provide the surface charge necessary to cause
electrostatic repulsion inhibiting HNTs agglomeration.
Finally, the antibacterial activity of the hybrid materials was assessed against the Gram
(-) bacterial strain Escherichia coli and the Gram (+) bacterial strain Staphylococcus aureus. It
was found that HNTs-PEGQ and HNTs-PEGS exhibited almost the same antibacterial activity
as that of the parent HNTs, while HNTs-PEGTPP showed enhanced antibacterial properties
against both tested organisms, especially against Gram (-) E. Coli bacteria, revealing that the
presence of triphenylphosphonium group endowed the hybrids with enhanced antibacterial
properties. SEM images revealed that probably due to the ionic character of the hybrids,
PEGylated HNTs strongly interact with charged components of the outer leaflet of the bacterial
cytoplasmic membrane and cell walls through multiple interactions, including electrostatic and
hydrogen bonding, leading to cell envelope damage, leakage of the bacterial cytoplasm to the
external medium and finally to cell lysis. It is of importance to note that, all hybrids exhibited
minimal cytotoxicity against selected mammalian cells in the concentration range that showed
antibacterial activities, indicating that these hybrid nanomaterials and especially HNTs
PEGTPP, have great potential to be used as safe and efficient antibacterial agents.
(EN)
/aggregator-openarchives/portal/institutions/uoa
