Pescadillo is a highly conserved eukaryotic gene from yeasts to human, and it has been
shown to impact on both the cell cycle and on ribosome biogenesis, the later through the
processing of pre-rRNAs. Interestingly, in mammals, pescadillo expression has been
found to be up regulated in various cancers. Respective studies for the plant orthologues
were lacking, and the functional role of these genes for plant growth and/or
differentiation remained unknown. With the present study, the plant orthologues of
pescadillo gene from the angiosperms Arabidopsis thaliana and Zinnia elegans,
designated respectively as AtPES and ZePES, were isolated and characterized. In silico
analysis of the polypeptide chain of the respective proteins showed that they are highly
homologous with orthologues from other organisms, yet they constitute a separate
group in the phylogenetic dendrogram. The primary structure of AtPES and ZePES
proteins mainly consists of 1) a N-terminus pescadillo domain and 2) a central BRCT
domain. At least three nuclear localization signals (NLS) are also found in the primary
structure of the plant orthologues.
AtPES expression was monitored throughout plant growth and reproduction,
using both a semi quantitative RT-PCR, and a histochemical GUS approach, in
transgenic plants designed to express the beta glucuronidase gene (GUS) under the
control of the AtPES promoter. Semi quantitative RT-PCR analysis revealed that AtPES
is ubiquitously expressed in all plant tissues tested. Furthermore, elevated levels of gene
expression were found in seedlings, root tips, apical portions of the shoot and in
developing and mature flowers. GUS analysis on the other hand clearly demonstrated
that AtPES is predominately expressed in meristematic and reproductive tissues such as
the root apical meristem (RAM), the developing primordia of the lateral roots, the shoot
apical meristem (SAM), the developing primordia of the aerial organs, the developing
and mature pollen, the developing megagametophyte and the developing embryos. A
weaker signal of GUS expression was observed in the stele of the root, in the trichome
progenitor cells, in the nerves of the leaves, especially in cotyledons, and in the
hydathode cells of the later. The subcellular localization of AtPES protein was studied
in transgenic Arabidopdis plants harboring a construct of AtPES fused to a gene
encoding for the yellow fluorescent protein YFP. It was shown that the chimerical
168
protein was targeted to the nucleolus, in specific sub domains that constitute the
granular component of the organelle, where the endonucleolytic cuts in the internal
transcribed spacers (ITS) of pre-rRNAs take place.
Semi quantitative RT-PCR analysis was conducted for monitoring the
expression of ZePES in the course of trans-differentiation of mesophyll cells to
tracheary elements in the in vitro system of Z. elegans. A reduction of ZePES
expression was observed 4 to 8 hours after the addition of the inductive medium. ZePES
expression was further shown to be up regulated 12, 16 and 20 hours following the
addiction of the inductive medium. Based on the expression of genes that mark specific
points of the cell cycle it could be deducted that ZePES expression is strong at G1/S and
G2/M checkpoints of the cell cycle.
Functional complementation experiments in budding yeast, using the
thermosensitive degron strain Y40047, have led to the discovery that AtPES and ZePES
can substitute for the endogenous yeast pescadillo orthologue in respects of normal
yeast growth, thus implying conserved functions of pescadillo proteins in yeasts and
plants. Moreover, yeast two hybrid system and bimolecular fluorescence
complementation experiments confirmed the physical interaction between AtPES and
both AtPEIP1 and AtPEIP2 proteins, thus providing evidence for the existence of a
heterotrimeric PeBoW complex in plants.
Overexpression of AtPES in transgenic Arabidopsis plants wasn’t shown to
impact on plant growth and development. In contrast, down-regulating the gene’s
expression by means of a RNA interference technology controlled by the addition of 17-
β-estradiol in the medium, led to a series of interesting phenotypes. A reduction up to
70% of the length of the primary root was observed. Microscopic examination of the
same roots revealed a series of phenotypic anomalies. In the root differentiation zone,
the cells of the epidermis and the cortex appear enlarged and distorted, whereas in the
RAM, the pattern of the cell files appears to be distorted in the severe phenotypes.
Furthermore, RT-PCR analysis revealed the accumulation of unprocessed 35S pre-
RNAs in the respective abnormal roots. On the whole our data indicate that AtPES is
essential for normal plant growth and development and that this gene is possibly linked
to specific, yet not elucidated to date mechanisms, that mediate the coordination of the
cell cycle and the cellular growth in the plant meristems.
For deciphering of AtPES transcriptional control, the 5’ untranslated region of
the gene was analyzed. A series of transgenic Arabidopsis lines were generated,
169
designed to express the GUS gene under the control of various, successive deletions of
the AtPES promoter. GUS expression in these lines was studied both qualitatively and
quantitatively. Analysis revealed important cis regulating elements such as the TELObox
and the site II motifs, which contribute to the differential expression of AtPES in
the various tissues and organs. Moreover, in site directed mutagenesis experiments
confirmed that TELO-box is crucial for the differential expression of AtPES gene
primarily in the RAM and secondly in the SAM.
Το pescadillo είναι ένα εξελικτικά συντηρημένο γονίδιο στις ζύμες και στους ζωικούς
οργανισμούς, ενώ λειτουργικά έχει δειχθεί ότι εμπλέκεται στην εξέλιξη του κυτταρικού
κύκλου και στη βιογένεση των ριβοσωμάτων δια μέσου της επεξεργασίας πρόδρομων
rRNA. Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης το γεγονός ότι η έκφρασή του είναι αυξημένη
σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, μέχρι σήμερα δεν είχε χαρακτηριστεί κανένα
ορθόλογο γονίδιο από τα φυτά και ο λειτουργικός τους ρόλος στην ανάπτυξη και
διαφοροποίηση των φυτικών ιστών παρέμενε άγνωστος. Στα πλαίσια της παρούσας
διατριβής απομονώθηκαν και χαρακτηρίστηκαν τα φυτικά ορθόλογα γονίδια του
pescadillo από τα αγγειόσπερμα Arabidopsis thaliana και Zinnia elegans, στα οποία
αποδόθηκαν οι ονομασίες AtPES και ZePES αντίστοιχα. Η in silico ανάλυση της
αμινοξικής αλληλουχίας των πρωτεϊνών έδειξε ότι παρουσιάζουν σημαντικό βαθμό
ομολογίας με αυτές άλλων οργανισμών, σχηματίζοντας ωστόσο το δικό τους κλάδο στο
φυλογενετικό δενδρόγραμμα. Η πρωτοταγής τους δομή αποτελείται από 1) μια
αμινοτελική pescadillo λειτουργική περιοχή και 2) από μια κεντρική BRCT
λειτουργική περιοχή, ενώ παρουσιάζει τουλάχιστον τρία σήματα πυρηνικού εντοπισμού
(NLS).
Το αναπτυξιακό πρότυπο της έκφρασης του AtPES μελετήθηκε τόσο με
ημιποσοτική RT-PCR όσο και με ιστοχημική ανάλυση GUS σε διαγονιδιακά φυτά
Arabidopsis, που εξέφραζαν το γονίδιο της β-γλουκουρονιδάσης (GUS) υπό την
καθοδήγηση του υποκινητή του AtPES. Τα αποτελέσματα της RT-PCR έδειξαν ότι το
γονίδιο εκφράζεται σε όλους τους ιστούς των φυτών που μελετήθηκαν, ενώ
παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση στα αρτίβλαστα, στα ακρόρριζα, σε ακραία τμήματα
των βλαστών, όπως επίσης και σε αναπτυσσόμενα και ώριμα άνθη. Με την κατά GUS
ιστοχημική ανάλυση βρέθηκε ότι το γονίδιο εκφράζεται πρωτίστως στους
μεριστωματικούς ιστούς, όπως στο ακραίο μερίστωμα της ρίζας (ΑΜΡ), στις καταβολές
πλάγιων ριζών, στο ακραίο μερίστωμα του βλαστού (ΑΜΒ) και στις καταβολές των
οργάνων. Επίσης, παρατηρήθηκε έντονη παρουσία σήματος GUS στα πρόδρομα
κύτταρα των γυρεόκοκκων, με το σήμα να διατηρείται και στους ώριμους
γυρεόκοκκους. Παράλληλα παρατηρήθηκε έκφραση GUS στις ωοθήκες και στα
αναπτυσσόμενα έμβρυα. Το γονίδιο εκφράζεται ασθενέστερα στον κεντρικό κύλινδρο
164
της ρίζας, στα πρόδρομα κύτταρα των τριχών των φύλλων, στις νευρώσεις των φύλλων
και κυρίως των κοτυληδόνων καθώς και στα κύτταρα των υδατωδίων των τελευταίων.
Η ενδοκυτταρική τοπολογία της πρωτεΐνης AtPES μελετήθηκε σε κατάλληλα
μετασχηματισμένα φυτά που εξέφραζαν μια κατασκευή μεταφραστικής σύντηξης του
AtPES με το γονίδιο της φθορίζουσας πρωτεΐνης YFP.
είχτηκε ότι η AtPES-YFP
πρωτεϊνική χίμαιρα εντοπίζεται στον πυρηνίσκο των κυττάρων, και εντονότερα, σε
διακριτές περιοχές που συνιστούν το κοκκώδες τμήμα του οργανιδίου, στο οποίο
πραγματοποιείται η ενδονουκλεολυτική πέψη στα ITS (internal transcribe spacers) των
πρόδρομων rRNA.
Η έκφραση του ZePES μελετήθηκε με ημιποσοτική RT-PCR κατά τη διάρκεια
της αποδιαφοροποίησης και ακόλουθης επαναδιαφοροποίησης κυττάρων του
μεσοφύλλου σε τραχειακά στοιχεία, στο in vitro κυτταρικό σύστημα του Z. elegans.
Παρατηρήθηκε μείωση της έκφραση του ZePES 4 και 8 ώρες μετά την προσθήκη του
επαγωγικού μέσου καλλιέργειας, και ακόλουθη αύξηση στους χρόνους 12, 16 και 20
ώρες μετά την προσθήκη του επαγωγικού μέσου. Σύμφωνα με τα πρότυπα γονιδίων
μαρτύρων του κυτταρικού κύκλου, τα μετάγραφα του ZePES είναι άφθονα στις φάσεις
ελέγχου του κυτταρικού κύκλου G1/S και G2/M.
Πειράματα συμπληρωματικότητας των AtPES και ZePES χρησιμοποιώντας το
θερμοευαίσθητο μεταλλαγμένο στέλεχος degron Υ40047 του ζυμομύκητα οδήγησαν σε
διάσωση του θνησιγενούς φαινοτύπου της ζύμης, υποδεικνύοντας τη λειτουργική
συντήρηση μεταξύ φυτών και ζύμης. Επίσης, με τη χρησιμοποίηση τόσο του
συστήματος των δύο υβριδίων του ζυμομύκητα όσο και του συστήματος του
φθορισμού διμοριακής συμπληρωματικότητας, επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη των
ετεροδιμερών πρωτεϊνικών συμπλόκων AtPES-AtBOP1 και AtPES-AtWDR12,
υποστηρίζοντας την ύπαρξη ενός συντηρημένου ετεροτριμερούς συμπλόκου PeBoW.
Η υπερέκφραση του AtPES σε κατάλληλα μετασχηματισμένα φυτά δεν οδήγησε
στον εντοπισμό φαινοτυπικών ανωμαλιών σε σύγκριση με τα φυτά του αγρίου τύπου
στις συνθήκες που μελετήθηκαν. Αντίθετα, η καταστολή της έκφρασης του γονιδίου με
τη χρήση κατασκευών ελεγχόμενης (με 17-β-οιστραδιόλη) γονιδιακής σίγησης (RNAi),
οδήγησε σε μια σειρά από ενδιαφέροντες φαινοτύπους. Παρατηρήθηκε μείωση της
ανάπτυξης των φυτών και ιδιαίτερα μείωση του μήκους της κύριας ρίζας σε ποσοστό
που έφτανε το 70%. Η μικροσκοπική παρατήρηση παρασκευασμάτων ριζών από φυτά
με δριμύ φαινότυπο αποκάλυψε την ύπαρξη διογκώσεων και παραμορφώσεων στα
επιδερμικά κύτταρα και τα κύτταρα του φλοιού στη ζώνη διαφοροποίησης, όπως επίσης
165
και μια έντονη διατάραξη του πρότυπου του ΑΜΡ. Στα ίδια φυτά, παρουσία 17-β-
οιστραδιόλης, διαπιστώθηκε αύξηση των μετάγραφων του 35S πρόδρομου rRNA. Στο
σύνολό τους, τα παραπάνω αποτελέσματα συνηγορούν υπέρ ενός σημαντικού
αναπτυξιακού ρόλου για το AtPES γονίδιο, και την πιθανή εμπλοκή του σε βασικούς
μηχανισμούς συντονισμού του κυτταρικού κύκλου και της αύξησης των κυττάρων
στους μεριστωματικούς ιστούς.
Προκειμένου να μελετηθεί περαιτέρω ο τρόπος ρύθμισης του γονιδίου AtPES,
αναλύθηκε επίσης η 5’ ρυθμιστική περιοχή του.
ημιουργήθηκαν διαγονιδιακές σειρές
φυτών με διαδοχικές απαλοιφές του υποκινητή του AtPES και μεταγραφική σύντηξη
των τμημάτων του με το γονίδιο αναφοράς GUS. Η έκφραση του GUS στις σειρές
αυτές των φυτών μελετήθηκε ποιοτικά και ποσοτικά. Οι αναλύσεις αποκάλυψαν την
ύπαρξη σημαντικών cis ρυθμιστικών στοιχείων όπως π.χ. των TELO-box και των
μοτίβων site II, τα οποία συμμετέχουν στη διαφορική έκφραση του γονιδίου στους
διάφορους φυτικούς ιστούς και στα διάφορα όργανα. Επιπρόσθετα, πειράματα
στοχευμένης μεταλλαξιγένεσης απέδειξαν ότι το TELO-box εμπλέκεται καθοριστικά
στη διαφορική έκφραση του AtPES πρωτίστως ΑΜΡ και δευτερευόντως στο ΑΜΒ.
National Documentation Centre (EKT)
