Bone is an important and dynamic tissue that is being remodeled continuously
because of the balanced activity between osteoblasts and osteoclasts. After the process
of generation of new bone, osteoblasts are embedded in extracellular matrix or die by
apoptosis. Apoptosis is the programmed cell death that is mainly executed by
caspases and is characterized by morphological and biochemical changes in the dying
cell. Apoptosis signaling involves activation of the mitochondria or death receptors in
the cell surface, including TNF-alpha receptors.
TNF-alpha is an inflammatory cytokine that regulates important cellular
functions including apoptosis, cell proliferation and cell differentiation. The apoptotic
action of TNF-alpha is prevented by activation of NF-KB transcription factor and
activation of cell survival kinases that regulate the expression of anti-apoptotic genes.
TNF-alpha regulates apoptosis partly through activation of matrix proteinases
including metalloproteinases (MMPs) and their specific inhibitors TIMPs (Tissue
Inhibitors of Metalloproteinases). Consequently, they are involved in several
physiological processes including cell growth, tissue remodeling and apoptosis and
pathological conditions including cancer growth and metastasis, inflammation,
autoimmune diseases, osteoarthritis and osteoporosis. According to recent
publications, TIMPs regulate several cellular functions including apoptosis and cell
proliferation, apart from inhibition of MMPs. Especially, an anti-apoptotic action has
been attributed to TIMP-1 in several cell types.
Based on the above observations the aims of the present study were as follows:
a. Effect of cytokines and growth factors that are secreted in bone microenvironment
in the expression of MMPs and TIMPs.
b. Study of TIMP-1 effect in TNF-alpha-induced apoptosis.
c. The mechanism of TIMP-1 anti-apoptotic action through its interaction with cell
surface receptors.
d. Study of the functional role of alphavbeta3 integrin receptor interaction with
TIMP-1 in resistance to apoptosis using specific inhibitors.
236
Firstly, we studied the expression levels of MMPs and TIMPs in MG63 cells
treated with IFN-gamma, TNF-alpha and TGF-beta and found that TIMP-1
expression levels were up-regulated in the presence of TNF-alpha. Up-regulation of
TIMP-1 in the presence of pro-apoptotic TNF-alpha was comparable to up-regulation
of TIMP-1 in the presence of anti-apoptotic TGF-beta. Moreover, treatment of MG63
cells with several concentrations of TNF-alpha did not reduce cell viability, nor
induced morphological and biochemical features of apoptosis, as caspase activation
and alterations in BCL-2 proteins expression. Taking into consideration the increased
expression of TIMP-1 in the presence of TNF-alpha and recent reports suggesting an
anti-apoptotic effect for TIMP-1 in several cell types, we made the hypothesis that
resistance of MG63 cells to apoptosis was partly attributed to increased expression of
TlMP-1. Our hypothesis was strengthened by our observation that TNF-alpha-induced
up-regulation of TIMP-1 is partly controlled by activation of NF-kappaB transcription
factor. To delineate the role of NF-kappaB in up-regulation of TIMP-1 expression
levels, we used PDTC, an inhibitor of NF-kappaB activation, and observed reduced
up-regulation of TIMP-1 in the presence of TNF-alpha. TNF-alpha-induced NFkappaB
activation was verified by p65 translocation from the cytoplasm to the
nucleus and is correlated with transcription activation of several anti-apoptotic genes
as well as activation of cell survival signalling pathways, including activation of
AKT/PKB kinase and both stress activated MAPKs, p38 and JNKs.
To further document the anti-apoptotic role of newly synthesized TIMP-1 in
MG63 cells, we studied the effect of TNF-alpha in MG63 cells sensitized to
apoptosis. Treatment of MG63 cells with CHX, a protein synthesis inhibitor, prior to
TNF-alpha addition, reduced cell viability and sensitized cells to apoptosis, as
indicated by microscopic examination, determination of DNA fragmentation and
detection of other biochemical markers of apoptosis (caspase-3 activation, proteolysis
of caspase substrate PARP, reduction of BCL-XL expression levels). In apoptotic
conditions, TIMP-1 expression levels were dramatically reduced. To further
investigate the protective role of TIMP-1 in MG63 cells, we have silenced the
expression of TIMP-1 using siRNA. TIMP-1 expression levels were dramatically
reduced in the above-mentioned cells, even in the presence of TNF-α. Upon TIMP-1
silencing, we observed reduced cell viability and sensitization to apoptosis, as
indicated by PARP cleavage and BCL-XL expression levels. Moreover, exogenously
237
added human recombinant TIMP-1 increased cell viability and reduced the extent of
apoptosis in MG63 treated with CHX prior to TNF-alpha addition.
Knowing that resistance of MG63 to TNF-alpha is partly attributed to increased
TIMP-1 expression levels, we studied the activation of cell survival signalling
pathways that are mediated by cell surface adhesion receptors, integrins. In particular,
we focused at β1 and αvβ3 integrins, since it has been reported that they exert a
protective role against TNF-alpha-induced apoptosis. FACS analysis revealed reduced
expression levels of β1 integrin subunit and increased expression levels of αvβ3
integrin in the cell surface of MG63 cells treated with TNF-alpha. Cell surface
expression levels of both β1 and αvβ3 integrins were reduced in MG63 cells pretreated
with CHX prior to TNF-alpha, whereas there was no statistical significant
difference in cell surface expression levels of MG63 cells treated with CHX alone.
According to previous reports the protective role of TIMP-1 against apoptotic
stimuli involves TIMP-1 interaction with β1 integrin subunit at the cell surface and
activation of cell survival pathways. Next, we attempted to detect TIMP-1 interaction
with αvβ3 integrin, which also has an anti-apoptotic effect. Confocal microscopy and
immunoprecipitation experiments revealed colocalization of TIMP-1 with αvβ3
integrin in the cell surface of MG63 cells. To futher explore the functional role of
TIMP-1 interaction with αvβ3 integrin, we used specific integrin inhibitors. In
particular, we used echistatin (integrin inhibitor with high affinity for αvβ3 integrin)
and the specific monoclonal antibody against αvβ3 integrin, LM609. Our results
showed reduced protection by TIMP-1 in MG63 cells pretreated with echistatin, as
indicated by estimation of cell viability and PARP cleavage. Contrarily, LM609
monoclonal antibody - without disrupting TIMP-1 interaction with αvβ3 integrin -
causes increased expression-secretion of TIMP-1 and increases its protective effect.
In conclusion, our results suggest that MG63 osteosarcoma cells are resistant
against TNF-alpha-induced apoptosis with concomitant increased expression of
TIMP-1 and activation of NF-kappaB transcription factor and AKT/PKB, p38 and
JNK kinases. Resistance of MG63 cells against apoptosis is correlated with the
protective effect of TIMP-1, as indicated by TIMP-1 silencing or addition of
exogenous rTIMP-1; furthermore, it involves interaction of TIMP-1 with αvβ3
integrin and possibly activation of cell survival pathways.
Ο οστίτης ιστός είναι ένας πολύ σημαντικός και δυναμικός ιστός, αφού
συνεχώς ανακατασκευάζεται από την ισόρροπη δράση οστεοβλαστών-οστεοκλαστών.
Οι οστεοβλάστες, αφού σχηματιστεί το οστό, είτε ενσωματώνονται στην εξωκυττάρια
μήτρα, είτε οδηγούνται σε απόπτωση. Επομένως, για τη διατήρηση της οστικής μάζας
στον ενήλικα είναι κρίσιμη η ρύθμιση της απόπτωσης των οστεοβλαστών. Η
απόπτωση είναι ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος που μεσολαβείται κυρίως
από τις κασπάσες και προκαλεί μορφολογικές και βιοχημικές αλλαγές στο κύτταρο.
Το φαινόμενο της απόπτωσης σηματοδοτείται μέσω του μονοπατιού των
μιτοχονδρίων ή μέσω ειδικών υποδοχέων θανάτου που βρίσκονται στην κυτταρική
επιφάνεια, όπως οι υποδοχείς του TNF-α.
Ο TNF-α είναι μία κυτταροκίνη που αυξάνεται σε καταστάσεις φλεγμονής και
επηρεάζει σημαντικές λειτουργίες του κυττάρου όπως η απόπτωση, ο
πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση. Η αποπτωτική δράση του TNF-α
αναστέλλεται από την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-KΒ ή την
ενεργοποίηση κινασών κυτταρικής επιβίωσης, που επιτρέπουν την έκφραση μορίων
με αντι-αποπτωτική δράση. Ο TNF-α συμμετέχει στη ρύθμιση της απόπτωσης και
μέσω της ενεργοποίησης πρωτεολυτικών ενζύμων (όπως οι μεταλλοπρωτεάσες) και
των ειδικών αναστολέων τους, TIMPs (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases).
Κατά συνέπεια, ρυθμίζουν φυσιολογικές διαδικασίες όπως η ανάπτυξη και η
αναδόμηση του ιστού και η απόπτωση, αλλά και παθολογικές καταστάσεις όπως η
ανάπτυξη και η μετάσταση του καρκινικού όγκου, η φλεγμονή, τα αυτοάνοσα
νοσήματα, η οστεοαρθρίτιδα και η οστεοπόρωση. Πολύ πρόσφατες αναφορές
αποδίδουν στους ΤΙΜΡs εκτός από την αναστολή των MMPs και άλλες ιδιότητες
όπως ρύθμιση της απόπτωσης και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ειδικότερα
στον ΤΙΜΡ-1 έχει αποδοθεί αντι-αποπτωτική δράση σε διάφορους κυτταρικούς
τύπους.
Σύμφωνα με τα παραπάνω οι στόχοι της παρούσας μελέτης ήταν:
Η προστατευτική δράση του ΤΙΜΡ-1 έναντι της επαγόμενης από τον TNF-α απόπτωσης
232
α. Η διερεύνηση της επίδρασης κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων που
εκκρίνονται στο μικροπεριβάλλον του οστού στην έκφραση των MMPs και ΤΙΜΡs.
β. Η διερεύνηση του ρόλου του ΤΙΜΡ-1 στην επαγόμενη από τον TNF-α απόπτωση.
γ. Η περαιτέρω μηχανιστική μελέτη της αντι-αποπτωτικής δράσης του ΤΙΜΡ-1 μέσω
της αλληλεπίδρασης του με υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας.
δ. Η μελέτη του λειτουργικού ρόλου της αλληλεπίδρασης του ΤΙΜΡ-1 με την
ιντεγκρίνη αvβ3 στην ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι της απόπτωσης με τη
χρήση κατάλληλων αναστολέων.
Αρχικά, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης των ΜΜΡs και ΤΙΜΡs μετά
από επεξεργασία των οστεοβλαστικών κυττάρων MG63 με IFN-γ, TNF-α και TGF-β
και διαπιστώθηκε αυξημένη έκφραση-έκκριση του ΤΙΜΡ-1 παρουσία TNF-α, ενός
παράγοντα που κυρίως επάγει απόπτωση, η οποία είναι συγκρίσιμη με εκείνη που
προκαλεί ο TGF-β, ο οποίος κατά τα γνωστά προστατεύει από την απόπτωση.
Παράλληλα, η ανάπτυξη των κυττάρων παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων
TNF-α δεν προκάλεσε μείωση στο ποσοστό της βιωσιμότητας των κυττάρων, ούτε
ανίχνευση μορφολογικών ή βιοχημικών χαρακτηριστικών απόπτωσης σύμφωνα με
τον προσδιορισμό βιοχημικών δεικτών απόπτωσης, όπως η ενεργοποίηση των
κασπασών και η έκφραση μορίων της οικογένειας BCL-2. Συνδυάζοντας την αύξηση
στην έκφραση του ΤΙΜΡ-1 παρουσία ΤΝF-α, ο οποίος κυρίως σηματοδοτεί
απόπτωση, και λαμβάνοντας υπόψη πολύ πρόσφατες μελέτες που αποδίδουν στον
ΤΙΜΡ-1 αντι-αποπτωτική δράση σε διάφορους κυτταρικούς τύπους διατυπωθηκε η
υπόθεση ότι η αντοχή των κυττάρων MG63 στην απόπτωση οφειλόταν εν μέρει στην
αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-1. Η υπόθεση αυτή ενισχύθηκε από παρατήρηση μας
σύμφωνα με την οποία η επαγόμενη από τον TNF-α αύξηση στα επίπεδα έκκρισης
του ΤΙΜΡ-1 ελέγχεται εν μέρει από την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα
NF-KΒ. Αυτό διαπιστώθηκε από τη διαφοροποίηση της έκφρασης του ΤΙΜΡ-1
παρουσία PDTC, ενός αναστολέα της ενεργοποίησης του NF-KΒ. Εξάλλου, η
ενεργοποίηση του NF-KΒ παρουσία TNF-α πιστοποιήθηκε από τη μετατόπιση της
p65 υπομονάδας από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα με ανάλυση των πυρηνικών και
κυτταροπλασματικών εκχυλισμάτων και μελέτη της υποκυτταρικής κατανομής της. Η
ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-KΒ, ο οποίος ρυθμίζει την έκφραση
γονιδίων με αντι-αποπτωτική δράση, συνδέεται με την ενεργοποίηση γνωστών
σηματοδοτικών μονοπατιών τα οποία περιλαμβάνουν την AKT/PKB, που είναι
Η προστατευτική δράση του ΤΙΜΡ-1 έναντι της επαγόμενης από τον TNF-α απόπτωσης
233
κομβική κινάση κυτταρικής επιβίωσης και τις ΜΑΡKs p38 και JNKs, που ρυθμίζουν
την απόπτωση κυρίως σε συνθήκες στρες.
Επειδή η αύξηση των επιπέδων έκφρασης του ΤΙΜΡ-1 παρουσία του TNF-α
σχετίσθηκε με προστασία από την απόπτωση, μελετήσαμε την επίδραση του TNF-α
σε έντονα αποπτωτικές συνθήκες, προεπωάζοντας τα κύτταρα με τον αναστολέα της
πρωτεϊνοσύνθεσης CHX πριν την επεξεργασία τους με τον TNF-α. Στις συνθήκες
αυτές παρατηρήθηκε μείωση του ποσοστού της βιωσιμότητας των κυττάρων η οποία
είχε χαρακτηριστικά απόπτωσης, όπως διαπιστώθηκε με μορφολογική εξέταση των
κυττάρων, προσδιορισμό των θραυσμάτων DNA με κυτταρομετρία ροής και
προσδιορισμό γνωστών βιοχημικών δεικτών απόπτωσης (ενεργοποίηση κασπάσης-3,
πρωτεόλυση του υποστρώματός της PARP, μείωση στα επίπεδα έκφρασης του αντι-
αποπτωτικού μορίου BCL-XL). Εξάλλου, το αποπτωτικό φαινόμενο συνδυάστηκε με
παράλληλη δραματική μείωση των επιπέδων του ΤΙΜΡ-1. Κατά συνέπεια,
διερευνήθηκε περισσότερο ο ρόλος του ΤΙΜΡ-1 στην προστασία των κυττάρων
MG63 από την απόπτωση. Για το λόγο αυτό αποσιωπήθηκε το γονίδιο του ΤΙΜΡ-1
με την τεχνική siRNA με αποτέλεσμα τη δραματική μείωση των επιπέδων έκφρασης
του ΤΙΜΡ-1 στα παραπάνω κύτταρα, η οποία ελάχιστα επηρεάστηκε από την
ανάπτυξη τους παρουσία TNF-α. Σε αυτά τα κύτταρα διαπιστώθηκε μείωση της
βιωσιμότητας και επαγωγή της απόπτωσης με βάση το ποσοστό πρωτεόλυσης του
PARP και τα επίπεδα έκφρασης του BCL-XL. Παράλληλα, κατά τη χορήγηση
ανασυνδυασμένου ανθρώπινου ΤΙΜΡ-1 εξωγενώς, παρατηρήθηκε μείωση του
ποσοστού της απόπτωσης και αύξηση του ποσοστού της βιωσιμότητας των κυττάρων
MG63 που είχαν επεξεργαστεί με τους παράγοντες TNF-α+CHX.
Δεδομένης της συσχέτισης μεταξύ της αυξημένης έκφρασης του ΤΙΜΡ-1 και
της κυτταρικής επιβίωσης παρουσία του TNF-α, διερευνήθηκε η πιθανή
ενεργοποίηση μηχανισμών κυτταρικής επιβίωσης μέσω υποδοχέων κυτταρικής
προσκόλλησης, όπως οι ιντεγκρίνες. Η περαιτέρω μελέτη επικεντρώθηκε στις
ιντεγκρίνες β1 και αvβ3 για τις οποίες έχει αναφερθεί ότι προστατεύουν τα κύτταρα
από την επαγόμενη από τον TNF–α απόπτωση. Με τη χρήση της κυτταρομετρίας
ροής παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων έκφρασης της β1 με παράλληλη αύξηση
της αvβ3 στην επιφάνεια των κυττάρων MG63 που είχαν αναπτυχθεί παρουσία TNF–
α. Σε αποπτωτικές συνθήκες προεπώασης των κυττάρων με CHX και ανάπτυξης
παρουσία TNF-α διαπιστώθηκε σημαντική μείωση των β1 και αvβ3 ιντεγκρινών στην
Η προστατευτική δράση του ΤΙΜΡ-1 έναντι της επαγόμενης από τον TNF-α απόπτωσης
234
κυτταρική επιφάνεια, ενώ παρουσία CHX δε διαπιστώθηκε σημαντική μεταβολή στα
επίπεδα έκφρασης των ιντεγκρινών β1 και αvβ3.
Σύμφωνα με προηγούμενη βιβλιογραφική αναφορά η προστατευτική δράση
του ΤΙΜΡ-1 έναντι αποπτωτικών παραγόντων σχετίζεται με την αλληλεπίδραση του
με τη β1 ιντεγκρινική υπομονάδα στην κυτταρική επιφάνεια και την ενεργοποίηση
μονοπατιών επιβίωσης. Προκειμένου να μελετηθεί η πιθανή αλληλεπίδραση του
ΤΙΜΡ-1 με την ιντεγκρίνη αvβ3 η οποία επίσης ενέχεται στην επιβίωση των
κυττάρων πραγματοποιήθηκαν πειράματα συνεστιακής μικροσκοπίας και
ανοσοκατακρήμνισης, οπότε διαπιστώθηκε συνεντοπισμός του ΤΙΜΡ-1 με την
ιντεγκρίνη αvβ3 στην επιφάνεια των κυττάρων MG63. Ο λειτουργικός ρόλος της
διασύνδεσης ΤΙΜΡ-1-αvβ3 προσδιορίστηκε με τη χρήση ειδικών αναστολέων των
ιντεγκρινών. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε η εχιστατίνη (αναστολέας των
ιντεγκρινών με συγγένεια για την αvβ3) και το ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι
της αvβ3, LM609. Με προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων και του
ποσοστού της απόπτωσης με βάση τα επίπεδα πρωτεόλυσης του PARP, διαπιστώθηκε
μειωμένη ικανότητα προστασίας των κυττάρων από την απόπτωση παρουσία ΤΙΜΡ-1
σε συνθήκες προεπώασης των κυττάρων με εχιστατίνη. Αντίθετα, το μονοκλωνικό
αντίσωμα LM609 δε δρα παρεμποδιστικά στην αλληλεπίδραση και επάγει αυξημένη
έκφραση-έκκριση του ΤΙΜΡ-1, με αποτέλεσμα να ενισχύεται περαιτέρω η
προστατευτική του δράση.
Συμπερασματικά, διαπιστώθηκε ανθεκτικότητα των κυττάρων MG63 έναντι
της απόπτωσης από τον TNF-α, με παράλληλη αύξηση των επιπέδων έκφρασης του
ΤΙΜΡ-1 και ενεργοποίηση του NF-KΒ και των κινασών AKT/PKB, p38 και JNKs. Η
ανθεκτικότητα έναντι της απόπτωσης σχετίζεται με την προστατευτική δράση του
ΤΙΜΡ-1, όπως διαπιστώθηκε σε συνθήκες αποσιώπησης του γονιδίου του ΤΙΜΡ-1
ή/και χορήγησης εξωγενώς ανασυνδυασμένου ΤΙΜΡ-1. Επίσης, συνδέεται με την
πρόσδεση του ΤΙΜΡ-1 στην ιντεγκρίνη αvβ3 και την πιθανή ενεργοποίηση
σηματοδοτικού μονοπατιού επιβίωσης.
National Documentation Centre (EKT)
