Crystallographic analysis of structure and function of cyclophilin enzymes and study of inclusion compounds of natural products in cyclodextrins

Κρυσταλλογραφική μελέτη δομής και λειτουργίας των κυκλοφιλινών και μελέτη εγκλεισμού φυσικών προϊόντων σε κυκλοδεξτρίνες

Crystallographic analysis of structure and function of cyclophilin enzymes and study of inclusion compounds of natural products in cyclodextrins

Χριστοφορίδης, Ηλίας

Christoforides, Elias

PhD Thesis

2013

Στη διατριβή αυτή, παρουσιάζεται η κρυσταλλογραφική ανάλυση με ακτίνες-Χ μεγάλων και μικρο-μεσαίων βιομορίων και συμπλόκων τους. Σκοπός του πρώτου μέρους της διατριβής είναι η επίλυση της δομής του ενζύμου της κυτταροπλασματικής κυκλοφιλίνης-Α από το αζωτοβακτήριο Azotobacter vinelandii (AvCyPA ή AvPPIB). Οι κυκλοφιλίνες καταλύουν την cis-trans ισομερίωση των πεπτιδικών δεσμών που προηγούνται του κατάλοιπου της προλίνης σε πρωτεϊνικά υποστρώματα. Η κρυσταλλική δομή του ενζύμου της AvCyPA προσδιορίστηκε σε διακριτότητα 2.2 Å, ενώ η κρυσταλλική δομή της σε σύμπλοκο με το συνθετικό τετραπεπτίδιο ηλεκτρύλιο– Ala–Phe–Pro–Phe–p–νιτροανιλίδιο σε 2 Å. Η προλίνη του πεπτιδίου υιοθετεί την cis διαμόρφωση. Παράλληλα, σχεδιάστηκαν σημειακές μεταλλάξεις εκτός του ενεργού κέντρου του ενζύμου προκειμένου να μελετηθεί η επίδρασή τους στη δομή και λειτουργία του ενζύμου. Ωστόσο, τα μεταλλάγματα AvPPIBA84S, AvPPIBΑ84Τ και AvPPIBΜ49Α δεν βρέθηκε να παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές στην δράση ισομεράσης σε σχέση με την φυσική πρωτεΐνη. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής παρουσιάζεται η ανάλυση των προϊόντων εγκλεισμού των d- και l- εναντιομερών βορνεόλης (ξενιζόμενα μόρια) σε α- και β- κυκλοδεξτρίνη (α-, β-CD) (μόρια ξενιστές) με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ. Η βορνεόλη είναι ένα δικυκλικό μονοτερπένιο, που απαντάται στα αιθέρια έλαια μιας πληθώρας φαρμακευτικών φυτών και χρησιμοποιείται στην φαρμακευτική. Τροποποιημένες κυκλοδεξτρίνες έχουν χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμού ρακεμικού μίγματος των δυο εναντιομερών. Η δομική μελέτη των συγκεκριμένων προϊόντων εγκλεισμού σε α- και β-CD, σκοπεύει να συμβάλει στην κατανόηση της ικανότητας μοριακής/χειρόμορφης αναγνώρισης από φυσικές κυκλοδεξτρίνες. Οι κρυσταλλικές δομές των προϊόντων εγκλεισμού d-/α-CD, l-/α-CD, d-/β-CD και l-/β-CD επιλύθηκαν με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ σε διακριτότητα περίπου 1 Å. Η γεωμετρία εγκλεισμού είναι παρόμοια μεταξύ των συμπλόκων των εναντιομερών στον ίδιο ξενιστή. Από την σύγκριση αυτών των δομών προκύπτει ότι το μόριο της βορνεόλης είναι λιγότερο αποδιατεταγμένο όταν εγκλείεται στην μικρότερη κοιλότητα των α-CD και πως η d- βορνεόλη εμφανίζει μικρότερη αποδιάταξη συγκριτικά με την αντίστοιχα εγκλεισμένη l-βορνεόλη.

In this thesis the X-ray crystallographic analysis of large and medium-small size biomolecules and their complexes is presented. The aim of the first part is the crystal structure determination of the cytoplasmic cyclophilin-A from Azotobacter vinelandii (AvCyPA or AvPPIB) bacterium. Cyclophilins catalyze the cis-trans isomerization of peptide bonds preceding proline residues of protein substrates. The crystal structure of AvCyPA was determined at 2.2 Å resolution. In addition, the crystal structure of the enzyme complexed with the synthetic tetrapeptide succinyl-Ala-Phe-Pro-Phe-p-nitroanilide was determined at 2.0 Å resolution and shows that the tetrapeptide proline adopts a cis-isomer conformation. Morever, we designed point mutants by changing aminoacids that are located outside from the active site of the enzyme in order to examine the influence of such a substitution on the overall dynamic structural network involved in catalysis. The AvPPIBA84S, AvPPIBA84T and AvPPIBM49A mutants showed little or no difference in PPIase activity in comparison with the native enzyme. The second part of this thesis deals with the crystal structures of the inclusion compounds of (d)- and (l)-borneol enantiomers in α- and β-cyclodextrin by X-ray crystallography. Borneol is a bicyclic monoterpene present in the essential oils of numerous medicinal plants used in pharmaceutical industry. Modified cyclodextrins have been used for chiral recognition of the two enantiomeric forms. The crystallographic study of these inclusion compounds aims to illustrate borneol enantioselectivity by complexation in native cyclodextrins. The crystal structures of the inclusion compounds of (d)- and (l)-borneol enantiomers in α- and β-CD were determined by X-ray crystallography at about 1 Å resolution. The complexes of the borneol enantiomers with the same host molecule have the same inclusion geometry. The results of this crystallographic analysis have shown that the borneol molecule is found significantly less disordered within the α-CDs dimer cavity than the larger β-CDs dimer cavity indicating that the complexation of the borneol with α-CD is more stable compared to that with β-CD and the encapsulated d-borneol molecule in the α- or β-CD dimer is found significantly less disordered than the l-borneol in the corresponding complexes.

Γεωπονικές Επιστήμες και Κτηνιατρική

Φυσική

Φυσικές Επιστήμες

Agricultural and Veterinary Sciences

Crystal structures

Γεωπονικές Επιστήμες και Κτηνιατρική

Προϊόντα εγκλεισμού

Borneol

Cyclodextrins

Βορνεόλη

Κρυσταλλική δομή

Κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ

Φυσικές Επιστήμες

X-ray crystallography

Κυκλοδεξτρίνες

Physical Sciences

Cyclophilin

Κυκλοφιλίνη

Φυσική

Inclusion complexes

Natural Sciences

Azotobacter vinelandii

Ισομεράσες προλίνης

Peptidyl-prolyl isomerases

Greek

Agricultural University of Athens

Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών. Τμήμα Γενικό. Εργαστήριο Φυσικής

National Documentation Centre (EKT)

National Archive of PhD Theses

Συλλογή ΕΑΔΔ