H παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που οδηγούν στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ (Nuclear Factor κB) κατά το μετασχηματισμό των Β-λεμφοκυττάρων από τον ιό Epstein Barr virus (EBV). Ο ιός EBV αποτελεί σημαντικό αιτιολογικό παράγοντα για την ανάπτυξη πολλών ανθρώπινων λεμφωμάτων που προέρχονται από Β-λεμφοκύτταρα, όπως είναι το ιδιαίτερα επιθετικό λέμφωμα Burkitt (BL). Ο ακριβής ρόλος του EBV στη διαδικασία της καρκινικής μετατροπής δεν είναι αποσαφηνισμένος, αλλά περιλαμβάνει την ικανότητά του να μολύνει αποτελεσματικά μη ενεργοποιημένα ανθρώπινα Β λεμφοκύτταρα και να τα μετασχηματίζει σε λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές σειρές που πολλαπλασιάζονται για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Η πρωτεΐνη LMP-1 του ιού είναι απαραίτητη για το μετασχηματισμό των Β-λεμφοκυττάρων και εμφανίζει ιδιαίτερα ογκογονικό χαρακτήρα. Ο μετασχηματισμός των Β λεμφοκυττάρων εξαρτάται απόλυτα από την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ, καθώς αναστολή της ενεργοποίησης του NF-κΒ προκαλεί την απόπτωση των μετασχηματισμένων Β-λεμφοκυττάρων. Η LMP-1 μιμείται τα κυτταρικά μηνύματα αύξησης που επάγονται μετά τη σύνδεση του υποδοχέα CD40 με τον προσδέτη του, χωρίς να απαιτεί την ύπαρξη συνδέτη για την επαγωγή σηματοδοτικών μονοπατιών, όπως είναι το κανονικό και το μη-κανονικό μονοπάτι του NF-κΒ.Οι πρωτεΐνες του NF-κΒ βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα όπου αλληλεπιδρούν με ανασταλτικές πρωτεΐνες, γνωστές ως αναστολείς του NF-κΒ (ΙκΒ πρωτεΐνες). Μετά την ενεργοποίηση από διαφορετικά και ποικίλα ερεθίσματα, οι πρωτεΐνες ΙκΒ φωσφορυλιώνονται, ουβικουϊτινώνονται και τελικά αποδομούνται από το πρωτεάσωμα. Η αποδόμηση των ΙκΒs οδηγεί στην απελευθέρωση του NF-κΒ και στη μετατόπισή του στον πυρήνα, όπου προσδένεται σε συγκεκριμένες αλληλουχίες υποκινητών ή ενισχυτών πάνω στο DNA και ρυθμίζει τη μεταγραφή πολλών γονιδίων, όπως είναι κυτταροκίνες, χημειοκίνες (IL-1α, IFNγ), ανοσοϋποδοχείς (μόρια του Μείζονος Συμπλέγματος Ιστοσυμβατότητας τάξης Ι-ΜΗC I), μόρια προσκόλλησης (ICAM, VCAM), μεταγραφικοί παράγοντες (Α20 και IRF1), παράγοντες αύξησης, ένζυμα (λυσοζύμη), ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου (κυκλίνη D1), αντι-αποπτωτικές πρωτεΐνες (BCL-XL), αναστολείς της απόπτωσης (c-IAP1, c-IAP2, XIAP). Η πειραματική προσέγγιση που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή ήταν η πρωτεωμική ανάλυση σε κυτταρικές σειρές ανθρώπινων B-λεμφοκυττάρων από λέμφωμα του Burkitt παρουσία και απουσία του ιού EBV (κυτταρικές σειρές BL41/B95.8 και BL41 αντίστοιχα), προκειμένου να προσδιοριστούν οι μεταβολές που επάγονται σε πρωτεϊνικό επίπεδο από τον EBV, καθώς είναι δυνατό να αποτελέσουν στόχους για προγνωστικές ή θεραπευτικές προσεγγίσεις σε ανθρώπινα λεμφώματα. Για την πρωτεωμική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν είτε ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα είτε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα, τα οποία αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν αρχικά σύμφωνα με το ισοηλεκτρικό τους σημείο, σε προκατασκευασμένες ταινίες ισοηλεκτρικής εστίασης ευρείας ή στενής περιοχής pH και στη συνέχεια ανάλογα με το μοριακό τους βάρος σε πήκτωμα SDS-πολυακρυλαμιδίου και ανιχνεύθηκαν με χρώση των πηκτωμάτων με νιτρικό άργυρο. Στη συνέχεια, έγινε σύγκριση των ηλεκτροφορητικών προφίλ των δύο κυτταρικών σειρών και απομονώθηκαν τα πρωτεϊνικά στίγματα εκείνα που εμφάνισαν διαφορά στη χρώση με νιτρικό άργυρο μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών.Τα πρωτεϊνικά στίγματα επωάστηκαν με θρυψίνη και τα πεπτίδια που προέκυψαν διαχωρίστηκαν σε τριχοειδείς στήλες χρωματογραφίας υψηλών πιέσεων (nano-HPLC). Τα πεπτίδια ιονίστηκαν με νάνο-ηλεκτροψεκασμό (nano-electrospray) και τα φάσματά τους αναλύθηκαν σε φασματογράφο μαζών τύπου ιοντοπαγίδας (ion-trap). Τα δεδομένα κατέληξαν σε βάσεις δεδομένων για την ταυτοποίηση της πρωτεΐνης. Τέλος, οι πρωτεΐνες κατηγοριοποιήθηκαν ανάλογα με τη μοριακή τους λειτουργία μέσω βάσεων δεδομένων (Gene-Ontology). Μέσω της τεχνικής της ηλεκτροφόρησης δυο διαστάσεων και της ταυτοποίησης των πρωτεϊνών (με φασματοσκοπία μάζας) που μεταβλήθηκαν εξαιτίας του EBV, βρέθηκαν πρωτεΐνες που μειορυθμίζονται και αυξορυθμίζονται στην EBV (+) κυτταρική σειρά (BL41/B95.8). Το σύνολο των πρωτεϊνικών διαφορών μπορεί να οφείλεται τόσο σε αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης των αντίστοιχων γονιδίων, όσο και σε μετα-μεταγραφικούς μηχανισμούς ή μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις ή ακόμα και σε ενδοκυτταρικές μετατοπίσεις. Πολλές πρωτεΐνες που βρέθηκαν να αυξορυθμίζονται στην EBV (+) κυτταρική σειρά, μπορεί να εμπλέκονται στην ανάπτυξη λεμφωμάτων και επομένως να αποτελούν νέους στόχους για την καταπολέμηση ασθενειών που σχετίζονται με τον ιό. Μερικές από τις πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη είναι ήδη γνωστό ότι επηρεάζονται είτε από τον ιό, είτε από μία ή περισσότερες ιικές πρωτεΐνες. Τέτοιες είναι η αννεξίνη Α6, ο CD40, η βιμεντίνη, η Mx1, η σερπίνη Β9, η ακτίνη, η PGK1, η UCHL1, η Lupus La πρωτεΐνη, η 14-3-3 έψιλον και η σταθμίνη-1. Υπήρξαν όμως και λίγες πρωτεΐνες οι οποίες βρέθηκαν να μειορυθμίζονται ή να αυξορυθμίζονται παρουσία EBV ή ιικών πρωτεϊνών και στη βιβλιογραφία να παρουσιάζεται το αντίθετο αποτέλεσμα. Για παράδειγμα η ενδοπλασμίνη βρέθηκε να μειορυθμίζεται και η D-3-φωσφογλυκερική αφυδρογονάση να αυξορυθμίζεται στην BL41/B95.8 κυτταρική σειρά, σε αντίθεση με μία πρόσφατη εργασία στην οποία εμφανίζεται το αντίθετο αποτέλεσμα στις αντίστοιχες EBV (+) (LCLs) κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν. Πρόσφατα δημοσιεύτηκαν δύο εργασίες οι οποίες παρουσιάζουν πρωτεΐνες αλλά και οικογένειες πρωτεϊνών που εμφανίζονται συχνά σε μελέτες πρωτεωμικής ανάλυσης, ανεξάρτητα από το είδος, τις in vivo ή τις in vitro συνθήκες, τα κύτταρα, τους ιστούς ή τα όργανα που χρησιμοποιούνται και τον πειραματικό στόχο. Μεταξύ αυτών υπάρχουν αρκετές που εντοπίστηκαν στην παρούσα πρωτεωμική ανάλυση, όπως είναι η αλδολάση Α, η υπεροξειρεδοξίνη-6 και οι ενολάσες. Μερικές από αυτές, παρά το γεγονός ότι εμφανίζονται συχνά σε πρωτεωμικές μελέτες, έχουν ιδιαίτερη σημασία και σχετίζονται με τον EBV, όπως συμβαίνει στην περίπτωση της βιμεντίνης, της αννεξίνης VI, της εζρίνης και της σταθμίνης-1. Τέλος από την σύγκριση των πρωτεϊνικών προφίλ των δύο κυτταρικών σειρών, προέκυψαν και πρωτεΐνες οι οποίες δεν σχετίζονται άμεσα με τον EBV ή με το λέμφωμα του Burkitt, όμως παίζουν ιδιαίτερο ρόλο στην κυτταρική αύξηση, στην εμφάνιση καρκίνου, στη ρύθμιση της ακτίνης, στην αναδιοργάνωση του σκελετού και σε άλλες μεταβολικές διαδικασίες. Μερικά παραδείγματα αυτών, αποτελούν η σεπτίνη-11, η πρωτεΐνη SET, η Ran/TC4, η Ly-GDI, η RPIA, η GPI και η DCK.Μεταξύ των πρωτεϊνών που βρέθηκαν να μειορυθμίζονται στην EBV (+) κυτταρική σειρά είναι τρεις πρωτεΐνες που ανήκουν στην ίδια οικογένεια: η COMMD2, η COMMD3 και η COMMD9. Η οικογένεια των COMMD πρωτεϊνών ανακαλύφθηκε σχετικά πρόσφατα και αποτελείται από δέκα μέλη. Το κύριο χαρακτηριστικό της οικογένειας αυτής είναι η παρουσία ενός μοναδικού και συντηρημένου μοτίβου που βρίσκεται προς το καρβoξυ-τελικό άκρο και λέγεται περιοχή COMM. Αυτή περιέχει συντηρημένα κατάλοιπα τρυπτοφάνης και προλίνης, είναι πλούσια σε κατάλοιπα λευκίνης και παίρνει μέρος σε πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Το πρώτο και καλύτερα χαρακτηρισμένο μέλος που ανακαλύφθηκε από την οικογένεια αυτή είναι η πρωτεΐνη COMMD1 (ή Murr1), η οποία εμπλέκεται σε πολλά και διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια (π.χ. εμπλέκεται στο μεταβολισμό του χαλκού, αναστέλλει την αντιγραφή του ιού HIV σε ήρεμα CD4+ T κύτταρα, δρα ανασταλτικά στη λειτουργία του ενεργού ενζύμου SOD1, αλληλεπιδρά με τον παράγοντα HIF-1α και επιφέρει την αποικοδόμησή του, εμπλέκεται στην ομοιόσταση του νατρίου, επάγει την ουβυκουϊτίνωση και τη αποικοδόμηση του NF-κΒ και αλληλεπιδρά με πλήθος μορίων όπως είναι η ARF, η GCN5 κτλ). Η COMMD1 παρεμποδίζει την ενεργότητα του NF-κB μέσα στον πυρήνα, καθώς προάγει την ουβικουϊτίνωση, την αποικοδόμηση και την απομάκρυνσή του από τις περιοχές-κΒ στα γονίδια-στόχους. Εκτός από την πρωτεΐνη COMMD1 και άλλες COMMD πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με NF-κB υπομονάδες.Δεν υπάρχουν πολλές διαθέσιμες πληροφορίες για τις COMMD πρωτεΐνες (COMMD2, COMMD3 και COMMD9) που βρέθηκαν να μειορυθμίζονται στην BL41/B95.8 κυτταρική σειρά. Από αυτές, η επιβεβαίωση της πρωτεϊνικής μειορύθμισής τους στην EBV (+) κυτταρική σειρά (π.χ. με τη χρήση αντισώματος), ήταν εφικτή μόνο για την COMMD9. Η COMMD9 είναι μια πρωτεΐνη που αποτελείται από 198 αμινοξέα, έχει μία περιοχή COMM και δύο ισομορφές. Η COMMD9 βρέθηκε να μειορυθμίζεται στην EBV (+) κυτταρική σειρά μέσω της τεχνικής της δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης. Η διαφορά στην έκφραση της COMMD9 επιβεβαιώθηκε και με την τεχνική του ανοσοστυπώματος κατά Western, σε ολικά κυτταρικά εκχυλίσματα τα οποία είτε αναλύθηκαν απευθείας σε πηκτώματα SDS πολυακρυλαμιδίου, είτε ακολουθήθηκε η τεχνική της δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης. Η διαφορική έκφραση της COMMD9 (και για τις δύο ισομορφές της) επιβεβαιώθηκε και σε μεταγραφικό επίπεδο με τις τεχνικές της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (RT-PCR) και της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qPCR). Η μειορύθμιση της COMMD9 πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε και στην LCL σειρά ΙΒ4, μία επιπλέον EBV (+) κυτταρική σειρά που περιέχει τέσσερα με πέντε αντίγραφα του ιικού DNA. Κατάλληλος αρνητικός μάρτυρας δεν υπάρχει για την ΙΒ4 κυτταρική σειρά και για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν Β-λεμφοκύτταρα από υγιή άτομα. Από τη σύγκριση μεταξύ ΙΒ4 και υγιών Β-λεμφοκυττάρων, η COMMD9 πρωτεΐνη βρέθηκε να μειορυθμίζεται στην EBV (+) κυτταρική σειρά. Ανάλογα πειράματα έγιναν και με την COMMD1 πρωτεΐνη η οποία αποτελεί το καλύτερα χαρακτηρισμένο μέλος των COMMD πρωτεϊνών, τα επίπεδα έκφρασης της οποίας δε φαίνεται να αλλάζουν μεταξύ EBV (+) και (-) κυτταρικών σειρών. Εκτός από την ΙΒ4 LCL, χρησιμοποιήθηκε και η EBV (+) κυτταρική σειρά BL31/B95.8, στην οποία τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών COMMD1 και COMMD9 ήταν παρόμοια με αυτά της κυτταρικής σειράς BL41/B95.8. Δυστυχώς η αντίστοιχη EBV (-) BL31 κυτταρική σειρά δεν μπορούσε να χρησιμοποιηθεί, καθώς δεν παρουσίαζε τα ίδια χαρακτηριστικά αύξησης και η καλλιέργειά της ήταν αδύνατη. Επειδή οι διαθέσιμες πληροφορίες για την COMMD9 πρωτεΐνη είναι αρκετά περιορισμένες, έγιναν πιλοτικά πειράματα υποκυτταρικού εντοπισμού από τα οποία προέκυψε ότι η COMMD9 είναι κυρίως κυτταροπλασματική και δεν ανιχνεύεται / εντοπίζεται σε πυρηνικά κλάσματα. Επιπλέον η COMMD9 είναι πολύ σταθερή πρωτεΐνη, τουλάχιστον όσον αφορά στις χρησιμοποιούμενες κυτταρικές σειρές, όπως προέκυψε από τα πειράματα με τη χρήση του κυκλοεξαμιδίου (CHX), αναστολέα της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Η COMMD9 δε φαίνεται να επηρεάζεται ούτε από τη χρήση του αναστολέα του πρωτεασώματος MG132. Τέλος, εξετάστηκε η επίδραση της αναστολής του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ με τη χρήση του BAY11-7082, στην έκφραση της COMMD9, σε πρωτεϊνικό και μεταγραφικό επίπεδο, αλλά η έκφραση της COMMD9 δε μεταβλήθηκε.Η παρουσία τριών από τα δέκα μέλη των COMMD πρωτεϊνών στην πρωτεωμική μας ανάλυση ήταν αξιοσημείωτη, δεδομένου ότι η τεχνική της δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης, σε συνδυασμό με τη χρώση με νιτρικό άργυρο, επιτρέπει το διαχωρισμό και τον εντοπισμό ενός μικρού ποσοστού του συνολικού πρωτεώματος. Για τους λόγους αυτούς εξετάστηκε η διαφορική έκφραση σε επίπεδο mRNA όλων των μελών της οικογένειας COMMD μεταξύ των κυτταρικών σειρών BL41 και BL41/B95.8. Οι περισσότερες από τις COMMD πρωτεΐνες βρέθηκαν να μειορυθμίζονται στην EBV (+) κυτταρική σειρά τόσο με την τεχνική RT-PCR (COMMD2, COMMD3, COMMD4, COMMD5, COMMD7, COMMD8, COMMD9 και COMMD10), όσο και με την τεχνική qPCR (COMMD2, COMMD3, COMMD4, COMMD7 και COMMD9). Από τα παραπάνω συμπεραίνεται ότι επτά από τα δέκα μέλη της οικογένειας COMMD φαίνεται να μειορυθμίζονται στην EBV (+) κυτταρική σειρά σε επίπεδο mRNA και τουλάχιστον τρεις σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Ένας ακόμα πιθανός τρόπος μειορύθμισης των CΟMMDs στην EBV (+) κυτταρική σειρά είναι μέσω των miRNAs. O ιός EBV ήταν ο πρώτος ιός στον οποίον βρέθηκαν miRNAs. Μέχρι σήμερα έχει βρεθεί ότι κωδικοποιεί για περίπου 30 miRNAs τα οποία επηρεάζουν την έκφραση κυτταρικών και ιικών πρωτεϊνών. Πέρα από τα ιικά miRNAs υπάρχουν και τα miRNAs του κυττάρου ξενιστή, τα οποία επίσης ρυθμίζουν την έκφραση πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό έγινε προσπάθεια πρόβλεψης των miRNAs (ιικών και κυτταρικών) τα οποία ενδεχομένως να χρησιμοποιούν τις COMMD ως στόχους, χρησιμοποιώντας κατάλληλους αλγόριθμους. Αν και αρκετές COMMD πρωτεΐνες φαίνεται να αποτελούν πιθανούς στόχους για miRNAs, δεν αποτελούν ιδιαίτερα καλό στόχο για κάποιο συγκεκριμένο ιικό miRNA. Όσον αφορά στα κυτταρικά miRNAs, βρέθηκε ότι μερικά μέλη της οικογένειας των COMMDs (COMMD2-3-8 και –10) αποτελούν στόχο για αυτά. H πειραματική επιβεβαίωση των παραπάνω προβλεφθέντων στόχων miRNAs δεν ήταν εφικτή, καθώς οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη δεν μπορούν εύκολα να διαμολυνθούν. Ο περιορισμός αυτός δεν επέτρεψε την υλοποίηση και άλλων πειραμάτων όπως είναι η εφαρμογή της τεχνικής του επεμβατικού RNA (siRNA) για την αποσιώπηση των COMMD πρωτεϊνών σε Β-λεμφοκύτταρα BL απουσία και παρουσία EBV και την εξέταση των αποτελεσμάτων αυτής της αναστολής στο κύτταρο και στην ενεργότητα του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ. Η τεχνική του επεμβατικού RNA (siRNA), θα μπορούσε να εφαρμοστεί για την αποσιώπηση και του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ και να εξεταστεί η επίδραση αυτής της αναστολής, στην έκφραση των COMMDs. Εξ’ αιτίας όμως της δυσκολίας του μετασχηματισμού των Β-κυττάρων χρησιμοποιήθηκε ο αναστολέας ΒΑΥ11-7082 ο οποίος, αν και δεν είναι τόσο αποτελεσματικός όσο η τεχνική του επεμβατικού RNA (siRNA), είναι ένας ευρέως διαδεδομένος αναστολέας του NF-κΒ.Λαμβάνοντας υπόψη ότι τρεις από τις δέκα πρωτεΐνες των COMMD πρωτεϊνών βρέθηκαν να μειορυθμίζονται στην EBV (+) κυτταρική σειρά σε πρωτεϊνικό επίπεδο και επτά σε επίπεδο mRNA, καθώς και ότι ο ιός EBV επάγει την ενεργοποίηση του NF-κΒ και οι πρωτεΐνες COMMD ρυθμίζουν αρνητικά την ενεργότητα του NF-κΒ μέσω ουβικουϊτίνωσης, προτείνεται ότι ο ιός EBV καταστέλλει την έκφραση συγκεκριμένων COMMD πρωτεϊνών, προκειμένου να διατηρεί ενεργοποιημένο το μονοπάτι του NF-κB και να επιτείνει την ογκογονική σηματοδότηση. Παραμένει να διερευνηθεί ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο ο ιός μειώνει τα επίπεδα έκφρασης των COMMD πρωτεϊνών και το πόσο σημαντικός είναι αυτός ο ρυθμιστικός μηχανισμός για την ανάπτυξη του λεμφώματος του Burkitt και των άλλων ασθενειών που σχετίζονται με τον EBV.
The aim of the present study was to investigate the molecular mechanisms leading to the activation of the transcription factor NF-κB (Nuclear Factor κB) during the transformation of B-lymphocytes by Epstein Barr Virus (EBV). EBV is a human herpes virus that mainly infects B cells and is the causative agent of diverse lymphoma types , such as Burkitt’s lymphoma (BL). The precise role of the virus in the development of these diseases remains unclear, although it is known that EBV can transform resting B-lymphocytes into lymphoblastoid cell lines (LCLs). LMP-1 is an oncogenic viral protein that is necessary for the transformation of B-lymphocytes. This transformation depends upon the activation of NF-κB pathways, since inhibition of NF-κΒ leads the transformed B-lymphocytes to apoptosis. LMP-1 resembles a constitutively active CD40 receptor and transmits sustained proliferation and survival signals in B cells through signalling pathways, such as the canonical and non-canonical NF-κΒ pathways.NF-κΒ proteins are found in the cytoplasm where they are bound with inhibitor proteins also known as Inhibitors of NF-κΒ (IκΒ proteins). Different stimuli can cause the IκΒ proteins to be phosphorylated, ubiquitinated and finally degraded by the proteasome. Subsequently, NF-κΒ gets released and translocates into the nucleus where it binds on distinct promoter DNA sequences thus regulating the transcription of genes, such as cytokines, chomokines (IL-1α, IFNγ), immunoreceptors (molecules of the Major Histocompatibility Complex I-MHC-I), adhesion molecules (ICAM, VCAM), transcription factors (Α20 and IRF1), growth factors, enzymes, cell cycle regulators (cyclin D1), anti-apoptotic proteins (BCL-XL) and inhibitors of apoptosis (c-IAP1, c-IAP2, XIAP).The experimental approach used in the present study was the proteomic analysis of human B-lymphocytes cell lines from Burkitt lymphoma in the presence or absence of EBV (cell lines BL41/B95.8 and BL41) respectively, so that alterations induced by EBV could be defined in the protein level. These alterations could potentially be used as targets for prognostic or therapeutic purposes in human lymphomas. For the proteomic analysis and the comparison of expressed proteins between these two cell lines, two-dimensional electrophoresis was used. In order to reduce sample complexity and increase the number of proteins separated and identified, we employed both sub-cellular fractionation of the cells in order to enrich cytoplasmic and nuclear fractions, as well as narrow-range isoelectric focusing (IEF) gels, in addition to whole cell lysates and broad range IEF. Proteins differentially stained with silver nitrate were excised and digested with trypsin. Nano-high performance liquid chromatography (nano-HPLC) was used for the separation of tryptic peptides. Eluting peptides were introduced online into an LCQ Deca ion-trap mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source. The MS raw file was searched using the SEQUEST algorithm against a merged and indexed IPI human (3.55) and EBV1/EBV2 protein database. Finally, for each identified protein the predicted or published molecular weight was checked against the one observed on the gels. Additionally the differentially proteins found were grouped according to their molecular function (Gene-Ontology).Using the two-dimensional electrophoresis technique (2DE) and protein identification by mass spectrometry, a number of proteins was found to be upregulated or downregulated in the EBV (+) cell line (BL41/B95.8). These proteomic alterations could be due to posttranscriptional mechanisms, posttranslational modifications or intracellular translocations.Confirming the validity of our experimental approach, several proteins, previously known to be regulated by EBV, were also found in our study and thus may be implicated in the development of lymphomas. Among them were vimentin, annexin VI, LDH-A, Interferon-induced GTP-binding protein Mx1, phosphoglycerate kinase 1 (PGK1), PI-9 or serpin B9, UCHL1 (ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1), CDK4, the La antigen (Lupus La protein), 14-3-3 epsilon, actin and stathmin-1. Although generally there was concordance between our results and those of previous studies, some exceptions were seen, such as endoplasmin, which was found downregulated in our study but upregulated elsewhere and D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, for which the opposite was true. Recently two studies were published identifying proteins or protein families, commonly found in many comparative proteomic studies irrespectively of the in vivo or in vitro conditions, the cells, the tissues or the experimental goal used and whose significance is therefore questionable. Some examples of these proteins that were also found in our study are: fructose biphosphate aldolase A, peroxiredoxin-6, alpha-enolase and gamma-enolase. However, some of the established targets of EBV infection mentioned above also belong to this list of generally detected proteins, e.g. vimentin, annexin VI, ezrin and stathmin-1. We therefore cannot exclude a role for a few additional such proteins with functions that may implicate them indirectly in EBV transformation. Additional proteins identified in our screen appear to play a role in growth regulation and cancer formation, while some are involved in actin regulation and the cytoskeleton or metabolic processes. They include septin-11, SET protein, Ran/TC4, ribose-5-phosphate isomerase, glucose-6-phosphate isomerase, Ly-GDI and deoxycytidine kinase.We noticed with interest in our screen that among the novel proteins found to be downregulated in the EBV (+) cell line were three members (COMMD2, -3 and –9) of a recently identified family, defined by the presence of a conserved motif called the COMM (Copper Metabolism gene MURR1) domain that contains conserved residues of tryptophan and proline, is rich in leucine residues and is implicated in protein-protein interactions. The family is evolutionarily conserved and consists of 10 members in vertebrates. The first member that was best characterised from this family is the protein COMMD1 (or Murr1), which is implicated in many diverse signaling pathways. It was first implicated in copper metabolism, facilitating copper excretion from the liver. It has also been shown to interact with different molecules such as ARF, GCN5 and HIF-1, probably promoting the ubiquitination and degradation of the latter. Similarly, it regulates NF-B by associating in the nucleus with E3 ubiquitin ligase, thus stabilizing the binding between SOCS1 and the amino-terminus of RelA, resulting in ubiquitination of NF-B. The other members of the family are less well characterized, however, they all seem to share the ability to interact with NF-B subunits and, by implication, affect their ubiquitination. In particular, COMMD3 and 9 have been found to bind and regulate RelB and p105, while COMMD2 can associate with a broad range of NF-B subunits.There is not much information available about the COMMD proteins found to be downregulated (COMMD2, -3 and –9) in the EBV positive cell line (BL41/B95.8) in our proteomic study. Antibodies are available against COMMD3 and COMMD9, but in our hands only the latter could recognize a specific band upon western-blotting. COMMD9 has one COMM domain and is expressed as two isoforms. The proteomic result of the differential expression of COMMD9 in the EBV (+) cell line was verified with Western analysis both in one-dimensional and two-dimensional gels. The differential expression of the two isoforms of COMMD9 was also verified in the transcriptional level using techniques such as RT-PCR and real time PCR (qPCR). In order to investigate whether this result is specific to the cell lines used, we also employed IB4, a lymphoblastoid cell line that contains four to five copies of viral DNA. As a control, we used B-lymphocytes from healthy individuals and it was found that COMMD9 protein levels were also reduced in this cell line. Similar experiments were conducted using an antibody against COMMD1, the protein that is best characterised from the COMMD family, whose levels do not seem to differ between EBV (+) and EBV (-) cell lines. Apart from IB4 LCL, another EBV (+) BL cell line was used, BL31/B95.8. The expression levels (protein and mRNA) of COMMD1 and COMMD9 were similar to those in the BL41/B95.8 cell line. Unfortunately the EBV (-) counterpart of the BL31/B95.8 cell line could not be tested because its culture was problematic.Since the available information concerning COMMD9 is very little, localization experiments were conducted from which it seems that COMMD9 is mainly located in the cytoplasm. In experiments with the protein synthesis inhibitor (Cycliheximide, CHX), COMMD9 appeared to be a very stable protein, at least for the cell lines used in this study. Furthermore, COMMD9 levels were not affected by the proteasome inhibitor MG132. Finally the effect of the NF-κΒ inhibitor BAY11-7082 was tested on the expression of COMMD9 at the protein and transcriptional level but again, expression levels of COMMD9 did not change. We were intrigued to see three members of this family as down-regulated in response to EBV infection. It is known that with 2DE and silver staining only a small portion of a mammalian proteome can be separated and detected. We therefore reckoned that additional members of the COMMD family may also be affected, but escaped detection in our proteomic screen. We therefore investigated the entire family at the mRNA level, using RT-PCR and real-time, qPCR between the cell lines BL41 and BL41/B95.8. Our findings suggest that at least seven members, COMMD2,3,4,7,8,9 and 10 are down-regulated by EBV infection, while COMMD1 and 6 are unaffected (COMMD5 was shown to be reduced with RT-PCR, but not with qPCR). Another possible way of COMMDs dowregulation in the EBV (+) cell lines is via the viral miRNAs that are expressed in the EBV (+) positive cell line. EBV is the first virus found to code for miRNAs. Till today there are almost 30 miRNAs found to be expressed by EBV. Apart from the viral miRNAs, the miRNAs of the host can also affect protein expression . This is why we used a bioinformatic model in order to predict which viral and cellular miRNAs can potently target COMMD proteins. Some COMMD proteins were found to be targets of viral miRNAs, while cellular miRNAs may target COMMD proteins as well.The experimental confirmation of the above was not applicable, since the cell lines used in the present study cannot be easily transfected. This limitation did not enable the conduction of other experimental procedures, such as the use of siRNA technology for silencing COMMD proteins in BL B-lymphocytes. The siRNA could have also been applied for NF-κΒ to investigate the outcome of this inhibition on COMMD expression . Due to this difficulty we used instead the NF-κB inhibitor BAY11-7082, which is a widely used but not very robust inhibitor. Our finding that three out of ten proteins were downregulated in our proteomic analysis and seven out of ten were downregulated at the mRNA level in the EBV (+) cell line, suggests a possible functional role for this regulation in oncogenic signaling by EBV in B-lymphocyte transformation. EBV exerts its transforming potential through the activation of NF-B pathways. On the other hand, the proposed role of COMMD proteins is negative regulation of NF-B function, mediating ubiquitination and degradation of this transcription factor. Thus, it is reasonable to suggest that by down-regulating COMMD proteins, the virus is further enhancing its effect on NF-B activation, by attenuating its degradation. It remains to be investigated how EBV reduces COMMD expression levels and how important this regulatory mechanism is for the development of Burkitt’s lymphoma and other EBV-associated diseases.
