In this study we have determined the last two consecutive enzymatic steps of de novo biosynthesis of PAF in protozoan Tetrahymena pyriformis, the dephosphorylation step and the stage of formation of PAF. We investigated the existence, the intracellular localization and properties of a phosphatidic acid phosphohydrolase which catalyzes the removal of the phosphate group and converts the 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphate to 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycerol (AAG). The enzymatic activity of phosphohydrolase is localized predominantly in membrane fractions. The microsomal activity showed two optimum pH, 7.0 and 9.0, respectively, while mitochondria showed a peak at pH 7.0. A wide range of temperature optimum was determined from 20 to 45°C. The enzymatic activity is independent of Mg++ and inhibited by Mg++ , Ca++ and Ν-ethylmaleimide (40% after incubation), while no effect was observed by F-, EDTA and EGTA. During the substrate specificity with diacyl-GP, the phosphohydrolase showed that prefers short length fatty chains at sn-2 and lyso- derivatives. Competition experiments showed that the palmitoyl-GP, palmitoyl -acetyl-GP (the acyl analog of PAF) and alkyl-GP inhibit, while dipalmitoyl-GP, b-GP, fructose-6-GP, p-nitrophenylphosphate, phosphocreatine and ATP do not affect the enzyme activity. The last step of the de novo biosynthesis of PAF beam comprises the enzymatic reaction in which a CDP-choline:cholinephosphotransferase carries phosphocholine from CDP-choline in the AAG. It has been found that the enzyme activity is distributed mainly in the mitochondria fraction of protozoan. The 50.3%, located in the mitochondrial fraction and 84.5% of the activity detected in the fraction of the inner mitochondrial membrane of protozoan. The mitochondrial enzyme has optimum pH of 7.4-8.5, apparent Km 80.5 mM substrate alkylaketyloglykeroli and optimum temperature 25oC. The formation of endogenous phosphatidylcholine (PC) is activated by the presence of ions and Mg++ Mn++, while the formation of PAF ion Mg++. The enzymatic activity of the mitochondrial fraction is completely lost within 1 day at 4 oC, and can be kept for 11 days at -80oC. The extraction of the enzyme from the inner membranes of mitochondria was achieved (40%) using 150 mM SCN- . The DEAE cellulose gave enzymatic activity with a peak at the elution, corresponding to 135 mM NaCI and the preparation can be maintained for 3 days at 4oC. The active fraction of Sephadex G-100 showed a molecular mass of 64 kDa. Purification by non-denaturing electrophoresis showed activity 74750 pmol/min/mg of protein corresponding to a purification factor of 1024. Following, SDS-PAGE electrophoresis of the active non-denaturing electrophoresis zone revealed a band corresponding to 65kDa. In conclusion, the presence of 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphate phosphohydrolase, dithiothreitol-insensitive cholinephosphotransferase, and AAG, as well as, the presence of PAF was been described in previous studies, in membrane fractions of protozoa, demonstrate that the protozoan biosynthesizing PAF through the de novo pathway.
Στην εργασία αυτή μελετήθηκαν τα δύο τελευταία διαδοχικά ενζυμικά στάδια της de novo βιοσύνθεσης του παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων (PAF) στο πρωτόζωο Tetrahymena pyriformis, το στάδιο της αποφωσφορυλίωσης και το στάδιο σχηματισμού του PAF. Ερευνήσαμε την ύπαρξη, τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό και τις ιδιότητες μιας φωσφατιδικής φωσφοϋδρολάσης, η οποία καταλύει την απομάκρυνση της φωσφορικής ομάδας και μετατρέπει το 1-O-αλκυλο-2-ακετυλο-sn-γλυκερο-3-φωσφορικό (AAGP) σε 1-Ο-αλκυλο-2-ακετυλο-sn-γλυκερόλη (AAG). Η ενζυμική ενεργότητα της φωσφοϋδρολάσης εντοπίζεται κυρίως στα μεμβρανικά κλάσματα. Η μικροσωμική ενεργότητα της φωσφοϋδρολάσης έδειξε δύο βέλτιστες περιοχές pH, σε 7,0 και 9,0 αντίστοιχα, ενώ στα μιτοχόνδρια έδειξε μία κορυφή σε pH 7,0. Μια ευρεία περιοχή βέλτιστης θερμοκρασίας δράσης προσδιορίσθηκε από 20 έως 45°C. Η ενζυμική ενεργότητα είναι ανεξάρτητη ιόντων Mg++, αναστέλλεται με Mg++, Ca++ και N-αιθυλμηλεϊμίδιο (40% μετά από επώαση), ενώ δεν επηρεάζεται από τα F-, EDTA και EGTA. Κατά την εξειδίκευση υποστρώματος με διακυλο-GP, η φωσφοϋδρολάση έδειξε ότι προτιμάει λιπαρές αλυσίδες κοντού μήκους στη sn-2 καθώς και λυσο-παράγωγα. Συναγωνιστικά πειράματα έδειξαν ότι το παλμιτοϋλο-GP, το παλμιτοϋλο-ακετυλο-GP (το άκυλο- ανάλογο του PAF) και το αλκυλο-GP αναστέλλουν ενώ τα διπαλμιτοϋλο-GP, β-GP, φρουκτοζη-6-GP, π-νιτροφαινυλοφωσφορικό, φωσφορική κρεατίνη και ATP δεν επηρεάζουν την ενζυμική ενεργότητα της φωσφοϋδρολάσης. Το τελευταίο στάδιο της de novo πορείας βιοσύνθεσης του PAF περιλαμβάνει την ενζυμική αντίδραση, κατά την οποία μια CDP-χολινη:χολινοφωσφοτρανσφεράση μεταφέρει φωσφοχολίνη από την CDP-χολίνη στην AAG. Έχει βρεθεί ότι η ενζυμική ενεργότητα κατανέμεται κυρίως στο κλάσμα των μιτοχονδρίων του πρωτόζωου. Το 50,3%, βρίσκεται στο κλάσμα των μιτοχονδρίων και το 84,5% αυτής εντοπίζεται στο κλάσμα των εσωτερικών μεμβρανών των μιτοχονδρίων. Το μιτοχονδριακό ένζυμο έχει βέλτιστη περιοχή pH από 7,4–8,5, φαινομενική Km 80,5 mM με υπόστρωμα AAG και βέλτιστη θερμοκρασία 25oC. Ο σχηματισμός της ενδογενούς φωσφατιδυλοχολίνης (PC) ενεργοποιείται από την παρουσία ιόντων Mg++ και Mn++, ενώ ο σχηματισμός του PAF από ιόντα Mg++. Η ενζυμική ενεργότητα του μιτοχονδριακού κλάσματος χάνεται πλήρως μέσα σε 1 ημέρα στους 4oC, ενώ μπορεί να διατηρηθεί για 11 ημέρες στους -80oC. Η εκχύλιση του ενζύμου από τις εσωτερικές μεμβράνες των μιτοχονδρίων, επιτεύχθηκε (40%) χρησιμοποιώντας 150mM SCN-. H DEAE κυτταρίνη έδωσε ενζυμική ενεργότητα με κορυφή κατά την έκλουση, που αντιστοιχεί στα 135mM NaCI και το παρασκεύασμα μπορεί να διατηρηθεί για 3 ημέρες στους 4oC. Το ενεργό κλάσμα έκλουσης του ενζύμου από στήλη μοριακής διήθησης Sephadex G-100 αντιστοιχεί σε μοριακή μάζα 64kDa. Ο καθαρισμός με μη μετουσιωτική ηλεκτροφόρηση έδειξε ενεργότητα 74750 pmol/min/mg πρωτεΐνης που αντιστοιχεί σε συντελεστή καθαρισμού 1024. Η μετουσιωτική ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE του εκχυλίσματος της ενεργής ζώνης της μη μετουσιωτικής ηλεκτροφόρησης έδωσε ζώνη με μοριακή μάζα 65kDa. Συμπερασματικά, η παρουσία της 1-O-αλκυλο-2-ακετυλο-sn-γλυκερο-3-φωσφορικο:φωσφοϋδρολάσης, μιας σταθερής σε διθειοθρεϊτόλη ενζυμικής ενεργότητας CDP-χολινη:χολινοφωσφοτρανσφεράσης, της αλκυλακετυλογλυκερόλης, καθώς και η παρουσία του PAF όπως αποδείχθηκε σε προηγούμενες μελέτες, στα μεμβρανικά κλάσματα του πρωτόζωου, αποδεικνύουν ότι το πρωτόζωο βιοσυνθέτει PAF μέσω της de novo πορείας.
