Υπόβαθρο. Τα κύτταρα φυσικοί φονείς ή κυτταροκτόνα κύτταρα (ΝΚ) και τα κύτταρα ΝΚΤ παίζουν βασικό ρόλο στην βακτηριακή λοίμωξη και τη σήψη, δεδομένου ότι λειτουργούν ρυθμιστικά μεταξύ της έμφυτης και της επίκτητης ανοσιακής απάντησης. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήθηκε ο ρόλος των ΝΚ και κυττάρων ΝΚΤ στην άμυνα του ξενιστή έναντι του Streptococcus pneumoniae, χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο πνευμονιοκοκκικής πνευμονίας και σήψης στους μύες. Μέθοδοι. Χρησιμοποιήσαμε τέσσερις ομάδες των C57BL/6 ποντικών (n= 5-15μύες/ομάδα για κάθε σετ πειραμάτων). Τα ζώα μολύνθηκαν με ενδοτραχειακή ενστάλλαξη 50μL εναιωρήματος S. pneumoniae (5x10⁵ cfu). Είκοσι-τέσσερις ώρες πριν από τον βακτηριακό ενοφθαλμισμό, η εξάντληση των κυττάρων ΝΚ επιτεύχθηκε με ενδοφλέβια (IV) χορήγηση του αντι-asialoGM1 πολυκλωνικού αντισώματος σε μία ομάδα, και το αντι-CD1d (κλώνος 1B1) μονοκλωνικό αντίσωμα δόθηκε για εξάντληση των κυττάρων ΝΚΤ σε μία δεύτερη ομάδα. Η ομάδα ελέγχου έλαβε ίσο όγκο μη ειδικού ισοτυπικού αντισώματος IV και μια τέταρτη ομάδα έλαβε ενδοτραχειακή εγκατάσταση φυσιολογικού ορού. Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν τα πειράματα θνησιμότητας όπου τα ζώα παρατηρήθηκαν καθημερινά για 7 ημέρες και οι θάνατοι καταγράφηκαν. Η καμπύλη επιβίωσης σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier και οι διαφορές στην επιβίωση μεταξύ των ομάδων συγκρίθηκαν με τη δοκιμασία log-rank. Στη συνέχεια, στα επόμενα σετ πειραμάτων, τα ζώα υποβλήθηκαν σε ευθανασία 48 ώρες μετά τον ενδοτραχειακό ενοφθαλμισμό του πνευμονιόκοκκου. Μετρήθηκαν τα επίπεδα της IFN-γ και IL-10 στον ορό και των IFN-γ και TNF-α στα υπερκείμενα πνευμονικού ιστού, όπως και δείγματα ιστών από τον πνεύμονα και το ήπαρ αναλύθηκαν για τον ποσοτικό προσδιορισμό βακτηριακών αποικιών. Επιπρόσθετα, επιχειρήθηκε απομόνωση των ΝΚ κυττάρων του σπληνός κι έγινε κυτταρομετρία ροής για να εξακριβωθεί η εξάντληση των ΝΚ και ΝΚΤ κυττάρων, να προσδιοριστεί η απόπτωση των σπληνοκυττάρων και να μελετηθούν συγκεκριμένοι κυτταρικοί πληθυσμοί του σπληνός. Παράλληλα, έγινε μελέτη έκφρασης του σπληνικού miRNA και mRNA με ειδικές δοκιμασίες και πραγματοποιήθηκε ιστολογική εξέταση του πνεύμονα. Συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων έγιναν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή one-way ANOVA για πολλαπλές ομάδες. Αποτελέσματα. Βρήκαμε ότι, in vivo εξάντληση ΝΚ κυττάρων βελτίωσε την επιβίωση μετά πνευμονιοκοκκική πνευμονία και σήψη στην ομάδα των ποντικών που έλαβαν το αντι-asialoGM1 αντίσωμα σε σύγκριση με τα πειραματόζωα που έλαβαν το μη ειδικό IgG αντίσωμα και με την ομάδα που έγινε εξάντληση των ΝΚΤ κυττάρων. Παρ' όλα αυτά, όταν επιχειρήθηκε εξάντληση των ΝΚΤ κυττάρων, η επιβίωση ήταν χειρότερη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, ωστόσο η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Επιπλέον, βρέθηκε ότι κατά την εξάντληση των κυττάρων ΝΚ, υπήρχε σημαντική αύξηση στη σπλήνα των CD3+/CD1d+ κυττάρων σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες. Επιπλέον, μετά εξάντληση των ΝΚΤ κυττάρων, τα σπληνικά CD3-/NK1.1+ κύτταρα αυξήθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες. Τα σπληνοκύτταρα που προήλθαν από τα πειραματόζωα που υπέστησαν πνευμονιοκοκκική πνευμονία και σήψη παρήγαγαν περισσότερη IFN-γ, όταν επωάστηκαν παρουσία LPS σε σύγκριση με την ομάδα που δεν υπέστη πνευμονία και σήψη. Η εξάντληση των ΝΚΤ κυττάρων οδήγησε σε μειωμένη απόπτωση των λεμφοκυττάρων σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, υψηλότερο βακτηριακό φορτίο στους πνεύμονες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου και με τα πειραματόζωα με εξάντληση των ΝΚ κυττάρων, και στο ήπαρ σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Ακόμα, μετά από εξάντληση των ΝΚΤ κυττάρων με τη χορήγηση του αντι-CD1d αντισώματος, τα σπληνοκύτταρα που απομονώθηκαν κι επωάστηκαν παρουσία ή απουσία IL-2 παρήγαν περισσότερη INF-γ σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες. H INF-γ στον ορό ήταν επίσης αυξημένη στην ομάδα όπου έγινε in vivo εξάντληση των ΝΚΤ κυττάρων σε σχέση με τις άλλες ομάδες. Η αύξηση της INF-γ στα υπερκείμενα των σπληνοκυττάρων επιβεβαιώθηκε και με τις δοκιμασίες miRNA και mRNA. Η μελέτη αυτών αποκάλυψε ότι τόσο το miR-200c όσο και το miR-29a ρυθμίστηκαν προς τα κάτω ενώ το miR125a-5p ρυθμίστηκε προς τα πάνω στα σπληνοκύτταρα κατά την εξάντληση των κυττάρων NKT, το οποίο σχετίστηκε με αυξημένη παραγωγή ΙFΝ-γ τόσο στον ορό όσο και στα υπερκείμενα των σπληνοκυττάρων στην ομάδα αυτή. Συμπέρασμα. Η μελέτη μας έδειξε ότι τα κύτταρα ΝΚ φαίνεται να συμβάλλουν στην θνησιμότητα σε πνευμονιοκοκκική πνευμονία. Για πρώτη φορά, έχουμε δείξει ότι η εξάντληση των κυττάρων ΝΚΤ οδήγησε σε μια αύξηση στο σπλήνα των ΝΚ (CD3-/NK1.1+) κυττάρων και σε αυξημένη παραγωγή ΙFΝ-γ, η οποία συνδέεται με συγκεκριμένες αλλαγές στην έκφραση miRNA των σπληνοκυττάρων.
Background. Natural killer (NK) and natural killer T (NKT) cells play a key role in bacterial infection and sepsis since they contribute in the bridging of innate and acquired immune responses. In this study, we investigated the role of NK and NKT cells in host defence against Streptococcus pneumoniae, using a murine pneumococcal pneumonia sepsis model. Methods. We used four groups of C57BL/6 mice (n=5-15mice/group for each set of experiments). Animals were infected intratracheally with 50μL of S. pneumoniae suspension (5x10⁵ cfu). Twenty-four hours prior to bacterial inoculation, NK cell depletion was achieved by intravenous (IV) administration of anti-asialoGM1 rabbit polyclonal antibody in one group, or anti-CD1d monoclonal antibody, clone 1B1 was given for NKT cell depletion in a second group. The control group received equal volume of isotype antibody control IV and a fourth group received sham intratracheal installation of normal saline. Initially, survival studies were performed where animals were observed daily for 7 days and deaths were recorded. The survival analysis was plotted using the Kaplan-Meier method and differences in survival between groups were compared with the log-rank test. Next, in the following set of experiments, animals were euthanized at 48 hours after bacterial inoculation. Serum levels of INF-γ and IL-10 and lung IFN-γ and TNF-α were measured and quantitative bacterial cultures were performed from lung and liver tissue samples. In addition, splenocyte NK isolation was attempted and flow cytometry was done in order to verify NK and NKT cell depletion, to determine splenocyte apoptosis rates and to study discrete spleen cell populations. Moreover, splenocyte specific miRNA expression analysis and lung histologic examination were also performed. Comparisons of numeric data between groups were made using the one-way ANOVA test for multiple groups. Results. We found that in vivo NK cell depletion improved survival after pneumococcal pneumonia and sepsis in the group of mice that received the anti-asialoGM1 antibody when compared with animals that received the non-specific IgG antibody and NKT depleted animals. Nevertheless, when NKT cell depletion was attempted, survival worsened compared to the control group, however that difference did not reach statistical significance. Moreover, we found that upon NK cell depletion, there was significant increase in spleen CD3+/CD1d+ cell population compared to NKT depleted, control and sham treated animals. Interestingly, upon NKT cell depletion, spleen CD3-/NK1.1+ cells increased significantly compared to NK depleted, control and sham groups. Splenocytes from control animals produced more IFN-γ after LPS stimulation than those from non-septic animals. NKT depletion led to decreased lymphocyte apoptosis compared to the control group, higher bacterial load in the lung compared to controls and NK depleted animals and in the liver compared to controls. In addition, serum levels of IFN-γ were significantly increased and splenocytes from NKT depleted animals, incubated ex-vivo in the presence or absence of IL-2, produced more IFN-γ in comparison with all other groups. Furthermore, splenocyte miRNA analysis showed that miR-200c and miR-29a were downregulated, while miR-125a-5p was upregulated in NKT depleted animals compared to all other groups, which was associated with higher serum and splenocyte INF-γ production in this group. Conclusion. Our study has shown that NK cells appear to contribute to mortality in pneumococcal pneumonia. For the first time we have shown that NKT cell depletion resulted in an increase in spleen NK (CD3-/NK1.1+) cells and a higher IFN-γ production, which were associated with specific changes in splenocyte miRNA expression.
