δείτε την πρωτότυπη σελίδα τεκμηρίου στον ιστότοπο του αποθετηρίου του φορέα για περισσότερες πληροφορίες και για να δείτε όλα τα ψηφιακά αρχεία του τεκμηρίου*
Μελέτη πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν την ιστόνη Η3
Polioudaki, Hara
Πολιουδάκη, Χαρίκλεια
Στην περιφέρεια του πυρηνικού φακέλου εντοπίζονται ένζυμα που τροποποιούν τις πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης όπως είναι η κινάση του LBR. Τα τελευταία χρόνια στα στοιχεία του πυρηνικού φακέλου έχει προστεθεί και η περιφερική ετεροχρωματίνη. Η ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 (ΗΡ1) αποτελεί κύριο καταστολέα του φαινομένου επίδρασης θέσης και ενέχεται στη δημιουργία και διατήρηση της δομής της χρωματίνης. Παλαιότερες μελέτες του εργαστηρίου μας, έχουν δείξει ότι η ΗΡ1 συνδέεται στον πυρηνικό φάκελο. Η σύνδεση αυτή πραγματοποιείται μέσω του σχηματισμού συμπλόκου ανάμεσα στον LBR τις νουκλεοσωμικές ιστόνες Η3/Η4 και την ΗΡ1.Η ΗΡ1 συνδέεται με ένζυμα όπως η μεθυλοτρανσφεράση Suvar 3-9, η οποία μεθυλιώνει την ιστόνη Η3 στη λυσίνη 9. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω θεωρήσαμε ενδιαφέρον να διερευνήσουμε την ύπαρξη πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν ιστόνες της ετεροχρωματίνης που συνδέονται με τον πυρηνικό φάκελο. Χρησιμοποιώντας την μέθοδο συγκατακρίμνησης πρωτεϊνών με σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης (GST pull-down) διαπιστώσαμε ότι μαζί με την ανασυνδιασμένη Μ31 (ΗΡ1β) συγκατακριμνίζεται εκτός από τις νουκλεοσωμικές ιστόνες και μια κινάση που φωσφορυλιώνει την Η3 στη θρεονίνη 3. Η κινάση συνδέεται με την Μ31 και όχι με τα νουκλεοσώματα. Για να μελετήσουμε την ύπαρξη και κατανομή της φωσφορυλιωμένης στη θρεονίνη 3 Η3 παράγαμε ένα πολυκλωνικό αντίσωμα που αναγνωρίζει την συγκεκριμένη τροποποίηση. Το αντίσωμα χαρακτηρίστηκε ως προς την ικανότητα του να αναγνωρίζει ειδικά τη φωσφορυλιωμένη στη θρεονίνη 3 Η3 με ELISA, ανοσοφθορισμό και ανοσοαποτύπωση. Δείξαμε την ύπαρξη της συγκεκριμένης τροποποίησης in vivo η οποία ανιχνεύθηκε σε όλες τις καρκινικές σειρές (τραχήλου της μήτρας, μαστού, προστάτη, λευχαιμικές) που εξετάσαμε καθώς και σε φυσιολογικά κύτταρα (πολυδύναμα μεσεγχυματικά και μυελού των οστών, ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα ποντικού). Η κατανομή της φωσφορυλιωμένης στη θρεονίνη 3 Η3 είναι παρόμοια για όλα τα είδη κυττάρων που μελετήσαμε.Όπως οι περισσότερες φωσφρορυλιώσεις των ιστονών έτσι και η συγκεκριμένη εντοπίζεται στη μίτωση. Η φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 3 αρχίζει στην πρόφαση και σταματάει να υφίσταται στο τέλος της ανάφασης. Κατά την πρόφαση εντοπίζεται γύρω από τον πυρηνικό φάκελο ενώ συνεχίζοντας στην προμετάφαση-μετάφαση παρατηρείται σε κεντρικές περιοχές των χρωμοσωμάτων καθώς και κατά μήκος των χρωμοσωμάτων. Τέλος κατά στην αρχή της ανάφασης ανιχνεύεται στα άκρα των χρωμοσωμάτων, ενώ δεν εντοπίζεται στην τελόφαση.Η καλύτερα μελετημένη φωσφορυλίωση της ιστόνης Η3 είναι η φωσφορυλίωση στην σερίνη 10. Σύγκριση των δύο τροποποιήσεων έδειξε διαφορές στην κατανομή τους. Αναλυτικότερα, η φωσφορυλίωση στη σερίνη 10 αρχίζει στη μεσόφαση (G2) και συνεχίζεται μέχρι το τέλος της μίτωσης όπου ανιχνεύεται στην περιφέρεια των νεοσχηματιζόμενων πυρήνων ενώ αντίθετα η φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 3 απουσιάζει τόσο κατά τη μεσόφαση όσο και στην τελόφαση. Στην πρόφαση τα δυο σήματα εντοπίζονται στην περιφέρεια του πυρηνικού φακέλου ενώ κατά τη μετάφαση διαχωρίζονται, με τη φωσροφυλιωμένη στη θρεονίνη 3 Η3 να εντοπίζεται κατά μήκος των χρωμοσωμάτων και κυρίως στα κεντρομερή Από τα μέχρι τώρα διαθέσιμα αποτελέσματα υπάρχουν σοβαρές ενδείξεις ότι το ένζυμο που φωσφορυλιώνει την ιστόνη Η3 στη θρεονίνη 3 συνδέεται ισχυρά με περιφερικές δομές του πυρήνα των κυττάρων. Συγκεκριμένα, πειράματα ανοσοφθορισμού που πραγματοποιήσαμε έδειξαν ότι κατά τα πρώιμα στάδια της πρόφασης, η φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 3 της Η3, αρχίζει ξεκάθαρα, από την περιοχή του πυρηνικού φακέλου. Επίσης η ενεργότητα της συγκεκριμένης κινάσης αρχικά, ανιχνεύθηκε σε παρασκευάσματα μεγάλης καθαρότητας, πυρηνικών φακέλων με περιφερική ετεροχρωματίνη, ενώ από πειράματα συγκατακρήμνισης βρέθηκε ότι η κινάση συνδέεται με την ΗΡ1 η οποία αλληλεπιδρά μέσω των ιστονών με τον LBR και κατ’ επέκταση με τον πυρηνικό φάκελο.
*Η εύρυθμη και αδιάλειπτη λειτουργία των διαδικτυακών διευθύνσεων των συλλογών (ψηφιακό αρχείο, καρτέλα τεκμηρίου στο αποθετήριο) είναι αποκλειστική ευθύνη των αντίστοιχων Φορέων περιεχομένου.
Βοηθείστε μας να κάνουμε καλύτερο το OpenArchives.gr.
