HURP protein (Hepatoma Up-Regulated protein) is a RanGTP regulated protein, originally identified inXenopus egg extracts, acting in complex with TPX2, XMAP215, Eg5 and Aurora A. HURP isa MAP that localizes to kt-MTs and is required for proper mitotic spindle assembly. HURP interactingpartners in mammalian cells, however, remained unknown.In this study, we describe the identification of a novel partner of HURP, CHD4 (ChromodomainHelicase DNA binding protein 4) a chromatin remodeling ATPase and a catalytic subunit of the NuRD(Nucleosome remodeling and histone Deacetylase) complex that was recently identified as a RanGTPdependentMAP.Our studies, in mammalian cells, showed that during mitosis CHD4 dissociated from mitoticchromosomes and localized to the spindle, indicating a new role of CHD4 in spindle assembly. Tobetter understand the function of CHD4, we performed RNA interference studies. Depletion of CHD4induced defects in spindle assembly and chromosome alignment in early mitosis, leading tochromosome missegregation. Furthermore, loss of CHD4 affected K-fiber stability by reducingsignificantly the quantity of kt-MTs, which are essential for chromosome biorientation and segregation.Upon CHD4 depletion, HURP’s localization was altered, loosing its preference for kt-MTs, indicatingthat CHD4 might regulate HURP’s localization. Finally, from in vitro and in vivo experiments we foundthat CHD4 is associated with the mitotic kinase Aurora A and the MAP TPX2, describing a newcomplex in mammalian cells.
Η πρωτεΐνη HURP (Hepatoma Up-Regulated protein) έχει αναγνωριστεί ως παράγονταςσυναρμολόγησης της ατράκτου (SAF) που ρυθμίζεται από τη RanGTP. Αρχικά βρέθηκε σε μιτωτικάεκχυλίσματα αυγών Xenopus laevis, σε σύμπλοκο με τις TPX2, XMAP215, Eg5 και Aurora A. Η HURPπροσδένεται στους μικροσωληνίσκους, εντοπίζεται κυρίως στους μικροσωληνίσκους των κινητοχώρωνκαι είναι απαραίτητη για την σωστή συναρμολόγηση της μιτωτικής ατράκτου. Παρόλο αυτά, πρωτεΐνεςπου αλληλεπιδρούν με τη HURP σε ανθρώπινα κύτταρα παραμένουν άγνωστες.Σε αυτή τη μελέτη περιγράφουμε την αναγνώριση μίας νέας πρωτεΐνης που αλληλεπιδρά με τη HURP,τη CHD4 (Chromodomain Helicase DNA binding protein 4) μία ATPάση της αναδιαμόρφωσης τηςχρωματίνης και καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου αποκετυλασών που ευθύνεται για τηναναδιαμόρφωση του νουκλεοσώματος (Nucleosome remodeling and histone Deacetylase - NuRD).Πρόσφατα η πρωτεΐνη CHD4 αναγνωρίστηκε ως πρωτεΐνη που προσδένεται στους μικροσωληνίσκουςκαι ρυθμίζεται από την RanGTP.Οι μελέτες μας σε ανθρώπινα κύτταρα έδειξαν ότι η CHD4 κατά τη μίτωση απελευθερώνεται από ταμιτωτικά χρωμοσώματα και εντοπίζεται στην άτρακτο, υποδεικνύοντας ένα καινούριο ρόλο της CHD4στη συναρμολόγηση της ατράκτου. Για να κατανοήσουμε τη λειτουργία της CHD4 πραγματοποιήσαμεμελέτες απαλοιφής της CHD4 με την τεχνική της αποσιώπισης γονιδίου με siRNA. Μείωση της CHD4προκαλεί βλάβες στη συναρμολόγηση της μιτωτικής ατράκτου και στη στοίχιση των χρωμοσωμάτωνστις αρχές της μίτωσης, οδηγώντας σε ανώμαλο διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων. Επιπλέον, ηαπώλεια της CHD4 επηρρεάζει τη σταθερότητα των K-fibers μειώνοντας σημαντικά την ποσότητα των μικροσωληνίσκων των κινητοχώρων. Μετά την απαλοιφή της CHD4, ο εντοπισμός της HURP βρέθηκενα αλλάζει, χάνοντας την προτίμησή της για τους μικροσωληνίσκους, των κινητοχώρων,υποδεικνύοντας την πιθανή ρύθμιση του εντοπισμού της HURP από την CHD4. Τέλος από in vitro καιin vivo πειράματα, βρήκαμε ότι η CHD4 αλληλεπιδρά με τη μιτωτική κινάση Aurora A και την πρωτεΐνηTPX2 που συνδέεται με μικροσωληνίσκους, δημιουργώντας ένα καινούριο σύμπλοκο σημαντικό για τηλειτουργία της μιτωτικής ατράκτου στα κύτταρα θηλαστικών.
