Οι οπιοειδείς υποδοχείς (OR), μ, δ, κ και NOP, είναι μέλη των επταελικοειδώνυποδοχέων που συζεύγνυνται με G πρωτεΐνες (7ΤΜ ή GPCR), οι οποίοι αποτελούν τη μεγαλύτερη υπεροικογένεια υποδοχέων και έναν από τους κύριους φαρμακολογικούς στόχους λόγω της υψηλής φυσιολογικής τους σημασίας. Οι OR ρυθμίζουν μια ποικιλία φυσιολογικών αποκρίσεων στο νευρικό σύστημα, με κυριότερη την αναλγησία. Τα οπιοειδή φάρμακα είναι τα πιο ισχυρά και αποτελεσματικά αναλγητικά έναντι στον οξύ πόνο, όμως η παρατεταμένη χρήση τους οδηγεί σε φαινόμενα ανοχής και εξάρτησης. Γι’ αυτό υπάρχει έντονο ενδιαφέρον στην αποσαφήνιση των μηχανισμών που εμπλέκονται στα φαινόμενα αυτά προκειμένου να σχεδιαστούν πιο αποτελεσματικά φάρμακα χωρίς τέτοιες παρενέργειες. Η σηματοδότηση των οπιοειδών υποδοχέων γίνεται κυρίως μέσω της ενεργοποίησης των Gi/o πρωτεϊνών που με τη σειρά τους ρυθμίζουν κατάλληλους τελεστές. Πέρα όμως από αυτούς τους κλασσικούς αλληλεπιδρώντες εταίρους οι OR έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν και με πολλές άλλες πρωτεΐνες κυρίως μέσω των περιοχών της τρίτης ενδοκυτταρικής τους θηλιάς (i3L) και του καρβοξυτελικού τους άκρου (CT) (Georgoussi et al., 2006- Georgoussi, 2008- Georgoussi et al.,2012). Οι αλληλεπιδράσεις αυτές επηρεάζουν όχι μόνο την σηματοδότηση των OR αλλά και την εν γένει εύρυθμη λειτουργία τους. Μια σημαντική πρωτεϊνική οικογένεια που ελέγχει τη μεταγωγή σήματος απότις G πρωτεΐνες βρέθηκε να είναι οι πρωτεΐνες Ρυθμιστές της κυτταρικής Σηματοδότησης μέσω G πρωτεϊνών ή RGS πρωτεΐνες (Regulators of G proteinsignaling RGS). Ο πρωταρχικός τους ρόλος είναι η αλληλεπίδραση τους με τις Gα υπομονάδες των G πρωτεϊνών και η επιτάχυνση της υδρόλυσης του GTP από τις τελευταίες οδηγώντας στη μείωση της σηματοδότησης των GPCR. Μέλη της οικογένειας των RGS πρωτεϊνών είχε δειχθεί ότι πέρα από τις Gα πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν επίσης με υποδοχείς GPCR, τελεστές αλλά και με άλλες ρυθμιστικές πρωτεΐνες, προσδίδοντας τους έναν ιδιαίτερο οργανωτικό ρόλο στη λειτουργία του κυττάρου και καθιστώντας τις RGS πρωτεΐνες μόρια υψηλού φαρμακολογικούενδιαφέροντος. Παρελθόντα πειράματα in vitro συγκατακρήμνισης, του εργαστηρίου Κυτταρικής Σηματοδότησης και Μοριακής Φαρμακολογίας, με τη χρήση GST-χιμαιρικών πεπτιδίων των καρβοξυτελικών άκρων των μ-OR και δ-OR (μ-CT και δ-CT αντίστοιχα) και της τρίτης ενδοκυτταρικής θηλιάς του δ-OR (δ-i3L), έδειξαν ότι η RGS4, ένα μέλος της B/R4 υποοικογένειας, αλληλεπιδρά και με τους δυο υποδοχείς στις περιοχές αυτές (Georgoussi et al., 2006- Leontiadis et al., 2009). Η αλληλεπίδραση της RGS4 στα καρβοξυτελικά άκρα των υποδοχέων αυτών γίνεται στην περιοχή που σχηματίζει μια 8η αμφιπαθική α-έλικα (έλικα VIII), σημείο επαφής των OR και για άλλες πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις όπως αυτή των STAT5A/B (Mazarakou and Georgoussi, 2005- Georganta et al., 2010), της σπινοφιλίνης (Fourla et al., 2012) και άλλων πρωτεϊνών (Georgoussi et al., 2012). Βρέθηκε επίσης ότι η RGS4 είναι αρνητικός ρυθμιστής της κυτταρικής σηματοδότησης των μ-OR και δ-OR (Georgoussi et al., 2006- Leontiadis et al., 2009). Τέλος, αποδείχθηκε για πρώτη φορά ότι η RGS4 παίξει το ρόλο «μοριακού φίλτρου» καθοδηγώντας τους μ-OR και δ-OR να αλληλεπιδράσουν με συγκεκριμένο διαφορετικό υποπληθυσμό Gα υπομονάδωντων G πρωτεϊνών (Leontiadis et al., 2009). Καμία πληροφορία για τον ρόλο των RGS πρωτεϊνών δεν υπάρχει για τον κ-OR. Για τον λόγο αυτό σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να ελέγξουμε αν οι RGS πρωτεΐνες της Β/R4 υποοικογένειας αλληλεπιδρούν με τον κ-OR και αν ναι, ποιος είναι ο ρόλος τους στη σηματοδότηση του κ-OR και των G πρωτεϊνών με τις οποίες ο τελευταίος συζεύγνυται. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ο κ-OR μπορεί να αλληλεπιδράσει και με την RGS4 και με την RGS2 τόσο in vitro όσο και in vivo. Η δημιουργία GST-χιμαιρικών πεπτιδίων του καρβοξυτελικού άκρου του κ-OR (κ-CT) έδειξε ότι η RGS4 αλληλεπιδρά επίσης εντός της έλικας VIII ενώ η RGS2 αλληλεπιδρά με το τελικό μη συντηρημένο άκρο του κ-CT όσο και του δ-CT. Επιπλέον η συνέκφραση της RGS4 ή της RGS2 σε κύτταρα 293F που εκφράζουν τον κ-OR έδειξε ότι και οι δυο RGS πρωτεΐνες προάγουν την επιλεκτική και διαφορική σύζευξη του κ-OR με συγκεκριμένο υποπληθυσμό των Gαi/o υπομονάδων. Σε ότι αφορά τον φυσιολογικό ρόλο των RGS4 και RGS2 στις ελεγχόμενες από τον κ-OR κυτταρικές αποκρίσεις βρήκαμε ότι τόσο η RGS4 όσο και η RGS2 ανέστειλαν την καταστολή της αδενυλικής κυκλάσης που ελέγχει ο κ-OR, αλλά όχι ο δ-OR, με την RGS2 να έχει ισχυρότερη επίδραση στο μονοπάτι αυτό. Επίσης οι RGS4 και RGS2 μείωσαν την ενεργοποίηση των ERK1,2 κινασών πουσηματοδοτούσε ο κ-OR. Τέλος, βρήκαμε ότι παρόλο που καμία από τις δυο RGS δεν επηρεάζει την εσωτερίκευση του κ-OR, η RGS4 επιταχύνει την εσωτερίκευση του δ-OR. Τα ευρήματά μας καταδεικνύουν ότι οι RGS4 και RGS2 πρωτεΐνες είναι δυο νέοι αρνητικοί ρυθμιστές στην σηματοδότηση των κ-OR και δ-OR. Εμφανίζουν διαφορικό ρυθμιστικό ρόλο στα σηματοδοτικά μονοπάτια καθενός OR, με ρόλο κλειδί στην καθοδήγηση της σύζευξής τους με τις Gα υπομονάδες και μπορούν νααποτελέσουν ενδιαφέροντες φαρμακολογικούς στόχους για τον έλεγχο της δράσης των οπιοειδών.
Οpioid receptors (OR) (subtypes μ, δ, κ and NOP) belong to the superfamily of the Heptahelical G protein-coupled receptors (7TM or GPCRs), the largest class of receptors in the human genome and common targets for therapeutics. ORs mediate their responses in the nervous system via coupling to members of the Gi/Go proteins to regulate the activity of various effector systems. Opioids are the most potent analgesics but prolonged administration leads to phenomena of tolerance and dependence thus there is a great interest towards understanding of OR signalling in an effort to develop new drugs devoid of adverse effects. Extended observations have demonstrated that the cytoplasmic face of the ORs is critical in mediating their signal through interactions not only with G proteins but also with multiple other proteins.These regulatory proteins play distinct roles in the regulation of the OR signalling,and in the fine tuning of these receptors. Regulators of G protein signalling (RGS) proteins is a class of proteins that modulate G protein signalling events by directly interacting with Gα subunits and accelerating the GTP hydrolysis, thus reducing GPCR signalling towards their effectors. RGS can also interact with many GPCRs, effectors and auxiliary proteinsthus playing a key role in the cell functions, making them highly attractive as pharmacological targets (Abramow-Newerly et al., 2006). Our previous in vitro studies have shown that a member of the B/R4 subfamily of RGS proteins, such as RGS4, interacts directly with μ-OR and δ-OR within a conserved region in their C-termini (μ-CT and δ-CT), forming a helix VIII, as well as within the δ-third intracellular loop (δ-i3L). RGS4 associates with μ-OR and δ-OR in living cells and forms selective complexes with Gαi/o proteins in a receptor dependent manner. Expression of RGS4 in HEK293 cells attenuated adenylyl cyclase inhibition mediated by μ-OR and agonist-mediated ERK1,2 phosphorylation for both receptors (Georgoussi et al., 2006- Leontiadis et al., 2009), suggesting for the first time that RGS4 is a negative modulator of μ-OR and δ-OR signalling. To deduce whether similar effects also occur for the κ-opioid receptor (κ-ΟR) and define the ability of other members of the B/R4 subfamily of RGS proteins, such as RGS2, to interact with OR we generated fusion peptides encompassing the C-terminus of κ-OR (κ-CT). Results from pull down experiments indicated that RGS2 interacts with the κ-CT, the δ-CT and the δ-i3L but fails to interact with the μ-CT. RGS4-N-terminal domain is responsible for OR interaction. Mapping the sites ofRGS2 interaction indicated that RGS2 interacts with the non conserved portion of the C-termini of ORs exhibiting a different docking site as compared to that of RGS4. Co-precipitation studies in living cells indicated that RGS2 and RGS4 associate with κ-ΟR constitutively and upon receptor activation and confer selectivity for coupling with a specific subset of G proteins in an RGS protein dependent manner. Expression of both RGS2 and/or RGS4, in 293F cells attenuated agonist mediated-adenylyl cyclase inhibition for κ-ΟR, but not δ-OR, with RGS2 exhibiting a more robust effect. RGS4 and RGS2 reduced κ-ΟR-mediated ERK1,2 phosphorylation whereas, RGS4 accelerated agonist-induced internalization of the δ-OR but not of the κ-OR. Collectively, our observations demonstrate that RGS2 and RGS4 are novel interacting partners and negative modulators of κ-ΟR and δ-OR signalling. These two RGS proteins display a differential modulatory effect in each signalling pathway tested and play a key functional role by conferring selectivity for both κ-OR and δ-OR coupling with a specific subset of G proteins. Therefore they can be considered as attractive new pharmacological targets to manipulate opioid receptors signalling.
