The term angiogenesis is used to describe the formation of new capillaries from existing ones. In response to various stimuli acting both on luminal and abluminal surface of the existing vessels, the basic membrane and the extracellular matrix underlying the endothelium are dissolved allowing the endothelial cells to migrate into extravascular space. There they proliferate and form sprouts that subsequently acquire newly formed basic membrane and are encircled by pericytes. The sprouts become functional on anatomic connection to the already existing segments of capillary network. Specific angiogenic growth factors have been well documented to initiate and promote this extremely complex process. Vascular Endothelial Growth factor (VEGF) stimulates the migration and proliferation of endothelial cells and smooth muscle cells as well as the production of proteases that are essential for the dissolution of the basic membrane of the vessels. Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) is a potent mitogenic factor for endothelial cells, smooth muscle cells and fibroblasts. It also upregulates VEGF and NO. Transforming Growth Factor β1 (ΤGF- β1), mainly produced by activated endothelial cells, promotes angiogenesis by recruiting pericytes to complete and stabilize the newly formed capillaries. It has been well documented in numerous animal and human studies that increased muscle activity consists a powerful stimulus for the formation of new capillaries in both skeletal muscles and heart muscle in order to meet their increased metabolic demands. Agiogenesis in response to increased muscle activity has been attributed to either metabolic stimuli, such as tissue hypoxia, or mechanical forces. The latter can be classified as (a) hemodynamic, acting on the luminal surface of the vessels i.e. wall tension and shear stress, due to increased blood flow and (b) extravascular, acting on the abluminal surface, as a result of muscular fiber contraction and relaxation. Mechanical forces associated with shortening and relaxation of the myocytes are imparted to the microvascular network via the extracellular matrix and connective tissue elements. Any mechanical injury caused to the endothelium by the above stimuli is sufficient to initiate the process of angiogenesis, through the realease of the angiogenic factors. The diaphragm, the main respiratory muscle that is longlife continuously and rhythmically contracting demonstrates characteristics of the skeletal muscles. It has been shown in animal and human studies that it exhibits the same angiogenic response to increased workload as locomotive muscles. Siafakas et al demonstrated increased VEGF and bFGF mRNA diaphragmatic levels in rats after 1 hour of increased ventilation due to hypercapnia and hypoxaemia, in contrast to animals with paralysed diaphragms. Increased mRNA expression of the VEGF was also found in the diaphragm of COPD and obese patients, compared to normal subjects, due to consequent increased respiratory workload. The aim of the present study was to assess the gene expression of the three major angiogenic factors (VEGF, bFGF and TGF-β1) in the human diaphragm before and after the application of different modes of mechanical ventilation. The study investigated the mRNA levels of the above angiogenic factors in the diaphragm of patients receiving general anaesthesia in relation to (a) active diaphragmatic contractions during spontaneous breathing with partial support and (b) passive diaphragmatic movement during controlled mechanical ventilation (CMV) with and without muscle relaxation. Women ASA physical status I-II scheduled for elective lower abdominal surgery (total hysterectomy) were enrolled in the study. All patients underwent combined general and thoracic epidural anaesthesia and were randomized in three groups according to the mode of ventilation intraoperatively. Group A received CMV with simultaneous administration of a neuromuscular blocking agent. Group B received also CMV but without neuromuscular blocking agent. Group C maintained spontaneous breathing on pressure support ventilation (PSV) mode. Diaphragmatic specimens (1-1.5cm3) were obtained from each patient at two different time points, 30 min after the induction of anaesthesia (t1) and 90 min subsequently (t2). The mRNA levels of VEGF, bFGF and TGFβ1 were measured using the Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (Real Time qPCR). Normalized mRNA levels of each angiogenic factor were statistically compared in groups A, B and C between the two time points, using the Student’s t-test and Mann-Whitney U test (2-tailed). Τhe present study showed increased diaphragmatic mRNA levels of VEGF (3.7-fold), bFGF and TFG-β1 (2.1-fold), at time t2 compared to t1, in patients receiving controlled mechanical ventilation without muscle relaxation (group B). Ιn contrast, the gene expression of the above factors did not exhibit significant changes, either during controlled mechanical ventilation with muscle relaxation, or pressure support ventilation (groups A & C, respectively).The increased angiogenic response in patients receiving CMV without muscle relaxation can be attributed to the increased mechanical stress that the diaphragm experienced during the positive pressure mechanical ventilation. The mechanical forces from the repetitive muscle fiber contraction and relaxation applied on the diaphragmatic capillaries, in parallel with respiratory cycles, created a powerful stimulus for diaphragmatic angiogenesis, at least at gene level. On the contrary, the administration of a neuromuscular blocking agent in patients who also received CMV diminished the muscle tone and subsequently the mechanical stress of the diaphragm and there was no signal for increased angiogenesis. In patients who breathed spontaneously, there was no apparent change in mechanical stimulus applied on the diaphragm, before and following PS ventilation. Our results cannot be attributed to other factors, since our patients did not exhibit haemodynamic instability, hypoxaemia or acidosis that would possibly affect the process of angiogenesis. Ιn conclusion, the present study demonstrated that controlled mechanical ventilation without neuromuscular blockade stimulated the angiogenic response, at least at gene level, contrary to controlled mechanical ventilation with simultaneous neuromuscular blockade as well as spontaneous breathing with PS. The different effect on angiogenesis was attributed to the different mechanical stress that the diaphragm experienced during the three different modes of ventilation. The absence of mechanical stress (unloading) of the diaphragm during controlled mechanical ventilation has been proved as the main factor leading to the so-called Ventilator Induced Diaphragmatic Dysfunction (VIDD), an entity including both muscular atrophy and contractile dysfunction. Our results shed light into the effect of the mode of mechanical ventilation on the angiogenesis of the diaphragm. Further studies are needed to investigate any potential relation between angiogenesis and diaphragmatic function during and after discontinuation of mechanical ventilation. Possibly, angiogenesis be a potential facror that modulates the impact of different modes of either controlled or assisted mechanical ventilation on diaphragmatic biology and function. Whether increased angiogenic response of a mechanically overloaded, non-paralysed diaphragm may be a preventive measure against mechanical ventilation-induced diaphragmatic dysfunction and muscle atrophy is a question to be answered in future studies. New therapeutic strategies may be developed under this consideration, aiming at the faster and safer weaning of critically ill patients from mechanical ventilation.
Ο όρος αγγειογένεση χρησιμοποιείται για να εκφράσει τη δημιουργία νέων αγγείων από τα ήδη υπάρχοντα. Υπό την επίδραση εξωγενών παραγόντων που δρούν στην εξωτερική και την εσωτερική επιφάνεια του αυλού των αγγείων, η βασική μεμβράνη και το εξωκυττάριο στρώμα του ενδοθηλίου αποδομούνται επιτρέποντας τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων στον διάμεσο χώρο, όπου πολλαπλασιάζονται και δημιουργούν ΄εκβλαστήσεις΄. Τα νεοσχηματισθέντα αγγεία αποκτούν βασική μεμβράνη που συντίθεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα περικύτταρα και στο τέλος συνδέονται ανατομικά και λειτουργικά με το υπάρχον αγγειακό δίκτυο. Για την έναρξη και το συντονισμό των παραπάνω πολύπλοκων διεργασιών είναι απαραίτητοι οι ειδικοί αυξητικοί παράγοντες αγγειογένεσης. O παράγοντας VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) είναι απαραίτητος για τη διάσπαση της βασικής μεμβράνης των αγγείων καθώς και για τον πολλαπλασιασμό και την εξάπλωση των ενδοθηλιακών κυττάρων και των λείων μυϊκών κυττάρων. Ο bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) αποτελεί ισχυρό μιτογόνο παράγοντα για τα ενδοθηλιακά, τα λεία μυϊκά κύτταρα και τους ινοβλάστες. Ο TGF-β1 (Transforming Growth Factor-β1), που παράγεται κυρίως από τα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα, προάγει την αγγειογένεση στρατολογώντας περικύτταρα για την ολοκλήρωση και σταθεροποίηση των νεοσχηματισθέντων αγγειακών σχηματισμών. Ως αποτέλεσμα μελετών σε πειραματόζωα και σε ανθρώπους, η αυξημένη μυϊκή δραστηριότητα αποτελεί ισχυρό ερέθισμα για τη δημιουργία νέων αγγείων, τόσο στo μυοκάρδιο όσο και στους σκελετικούς μύες, με σκοπό να αυξηθεί η αιματική τους ροή και να ανταποκριθούν στις αυξημένες μεταβολικές τους ανάγκες.Η έναρξη της αγγειογένεσης κατά τη μυική άσκηση πυροδοτείται από μεταβολές που υφίστανται τα αγγεία, όπως μεταβολικές (τοπική υποξία) και μηχανικές (μηχανικό stress). Οι μηχανικές δυνάμεις που εφαρμόζονται στην εσωτερική πλευρά των αγγείων, δηλαδή στο ενδοθήλιο, προέρχονται από την αύξηση της τάσης του αγγειακού τοιχώματος (wall tension) και των δυνάμεων τριβής που δρουν κατ’εφαπτομένη στο τοίχωμα (shear stress), λόγω της αυξημένης αιματικής ροής. Οι μηχανικές δυνάμεις που ασκούνται στο τοίχωμα των αγγείων από την εξωτερική πλευρά προέρχονται από τη σύσπαση των γειτονικών μυικών ινών. Τα τριχοειδή αγγεία των μυών υφίστανται, μέσω του εξωκυττάριου στρώματος (extracellular matrix) και του συνδετικού ιστού, επιμήκη ελαστική έκταση και κάμψη ακολουθώντας αντίστοιχα τη σύσπαση και χάλαση των γειτονικών μυικών ινών. H επακόλουθη ΄τραυματική βλάβη΄ του ενδοθηλίου αποτελεί το ισχυρό ερέθισμα για την ενεργοποίηση του ΄καταρράκτη΄ της αγγειογένεσης, μέσω της απελευθέρωσης των αγγειογενετικών παραγόντων. Το διάφραγμα που κατέχει ζωτική σημασία για τη λειτουργία της αναπνοής και συσπάται ρυθμικά καθόλη τη διάρκεια της ζωής εμφανίζει τα χαρακτηριστικά των σκελετικών μυών. Σε πειραματόζωα αλλά και σε ανθρώπους αυξήθηκε η γονιδιακή έκφραση των παραγόντων αγγειογένεσης στο διάφραγμα, όπως μετρήθηκε από τα επίπεδα mRNA των VEGF, bFGF και TGF-β1, όταν αυτό εκτέθηκε σε αυξημένο αναπνευστικό έργο (λόγω υποξυγοναιμίας ή / και υπερκαπνίας) ή σε αυξημένο μηχανικό φορτίο (λόγω χρόνιας αποφρακτικής πνευμονοπάθειας ή παχυσαρκίας).Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να εξετάσει τη γονιδιακή έκφραση των κυριoτέρων παραγόντων αγγειογένεσης (VEGF, bFGF, TGF-β1) στο ανθρώπινο διάφραγμα, κατά τη διάρκεια γενικής αναισθησίας, πριν και μετά την εφαρμογή διαφορετικών τύπων αερισμού: (α) υποβοηθούμενης πίεσης με ενεργητική σύσπαση του διαφράγματος και (β) ελεγχόμενου μηχανικού αερισμού, με ή χωρίς νευρομυικό αποκλεισμό, που συνεπάγεται παθητική κίνηση του διαφράγματος στη διάρκεια των αναπνευστικών κύκλων. Η υπόθεση της μελέτης ήταν η διατήρηση των ενεργητικών συσπάσεων του διαφράγματος κατά τον αερισμό υποβοηθούμενης πίεσης, σε ασθενείς υπό γενική αναισθησία, πυροδοτούν τη διαδικασία της αγγειογένεσης, σε αντίθεση με τον ελεγχόμενο μηχανικό αερισμό. Μελετήθηκαν γυναίκες ASA I-II που υποβλήθηκαν σε προγραμματισμένη επέμβαση κάτω κοιλίας (ολική υστερεκτομή) με συνδυασμένη γενική και επισκληρίδιο θωρακική αναισθησία. Οι ασθενείς τυχαιοποιήθηκαν σε 3 ομάδες, ανάλογα με τον τύπο του αερισμού που έλαβαν διεγχειρητικά. Η ομάδα Α τέθηκε σε ελεγχόμενο μηχανικό αερισμό με ταυτόχρονη χορήγηση νευρομυικού αποκλεισμού, η ομάδα Β σε ελεγχόμενο μηχανικό αερισμό χωρίς νευρομυικό αποκλεισμό, ενώ η ομάδα Γ διατήρησε την αυτόματη αναπνοή σε μοντέλο αερισμού υποβοηθούμενης πίεσης (pressure support). Σε κάθε ασθενή, λαμβάνονταν 2 δείγματα (1 - 1.5 cm3) από την ίδια περιοχή της πλευρικής μοίρας του διαφράγματος σε δύο χρόνους: 30 min μετά την εισαγωγή στην αναισθησία (t1) και 90 min αργότερα (t2). H γονιδιακή έκφραση των αγγειογενετικών παραγόντων VEGF, bFGFκαι TGF-β1 μετρήθηκε με τη μέθοδο της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-Time qPCR). Tα επίπεδα mRNA των παραπάνω παραγόντων συγκρίθηκαν ανάμεσα στις ομάδες, στους χρόνους t1 και t2, χρησιμοποιώντας το Student’s t-test και το Mann-Whitney U test (2-tailed). H παρούσα μελέτη έδειξε στην ομάδα Β αυξημένα επίπεδα mRNA για τον παράγοντα VEGF (3.7 φορές) και για τους παράγοντες bFGF και TGF-β1 (2.1 φορές) στο χρόνο t2, σε σχέση με το χρόνο t1. Η αύξηση των επιπέδων mRNA ήταν στατιστικά σημαντική για όλους τους αγγειογενετικούς παράγοντες. Αντίθετα, στις ομάδες Α και Γ παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων mRNA και των τριών αγγειογενετικών παραγόντων στο χρόνο t2, σε σχέση με το χρόνο t1, μη στατιστικά σημαντική.Η αυξημένη γονιδιακή έκφραση των τριών αγγειογενετικών παραγόντων στους ασθενείς που τέθηκαν σε ελεγχόμενο μηχανικό αερισμό χωρίς νευρομυικό αποκλεισμό (ομάδα Β) μπορεί να αποδοθεί στο αυξημένο μηχανικό stress του διαφράγματος. Η επίδραση των μηχανικών δυνάμεων από την επαναλαμβανόμενη σύσπαση και χάλαση των γειτονικών μυικών ινών στο αγγειακό δίκτυο του διαφράγματος, κατά τη διάρκεια του μηχανικού αερισμού, έδωσε το ερέθισμα για αυξημένη αγγειογένεση τουλάχιστον σε γονιδιακό επίπεδο. Αντίθετα, στην ομάδα Α που έλαβε επίσης ελεγχόμενο μηχανικό αερισμό, η χορήγηση του νευρομυικού αποκλεισμού κατάργησε τον μυικό τόνο του διαφράγματος ελαχιστοποιώντας το μηχανικό stress και έτσι δεν πυροδοτήθηκε η διαδικασία της αγγειογένεσης. Στην ομάδα Γ, προφανώς, δεν σημειώθηκε καμία μεταβολή στο μηχανικό stress του διαφράγματος πριν και κατά την εφαρμογή του pressure support. H παρούσα διατριβή πρόσθεσε ως νέο δεδομένο ότι ο ελεγχόμενος μηχανικός αερισμός χωρίς νευρομυικό αποκλεισμό προκαλεί το γονιδιακό ερέθισμα για αυξημένη αγγειογένεση στο διάφραγμα, σε αντίθεση με τον ελεγχόμενο μηχανικό αερισμό με τη χορήγηση νευρομυικού αποκλεισμού και τον αερισμό υποβοηθούμενης πίεσης. Η διαφορά στην αγγειογένεση αποδόθηκε σην αύξηση του μηχανικού φορτίου (stress) που δέχεται το διάφραγμα στον ελεγχόμενο μηχανικό αερισμό χωρίς τη χορήγηση νευρομυικού αποκλεισμού. Αντίθετα, η απουσία μηχανικής φόρτισης (unloading) του διαφράγματος είναι γνωστό ότι αποτελεί τον κύριο παράγοντα για τη μυική ατροφία και τη μειωμένη συσταλτική ικανότητα που παρατηρούνται στο μυ μετά από παρατεταμένο μηχανικό αερισμό. Επομένως, διαφαίνεται η πιθανή συμμετοχή της αγγειογένεσης στην επίδραση του τύπου του μηχανικού αερισμού στη λειτουργία του διαφράγματος. Η αποφυγή χορήγησης νευρομυικού αποκλεισμού για τη διατήρηση του μυικού τόνου του διαφράγματος, κατά την εφαρμογή του μηχανικού αερισμού, μπορεί να αποτρέψει τη λειτουργική διαταραχή του μυός. Νέες μελέτες στο μέλλον θα βοηθήσουν ώστε να αποσαφηνιστεί η επίδραση της αγγειογένεσης του διαφράγματος πάνω στη λειτουργία του διαφράγματος, τόσο στον ελεγχόμενο μηχανικό αερισμό, όσο και στα νεότερα μοντέλα υποβοηθούμενου αερισμού. Πιθανόν η ενίσχυση της διαδικασίας της αγγειογένεσης να βοηθήσει στην πρόληψη της μυικής ατροφίας και της δυσλειτουργίας του διαφράγματος. Νέες στρατηγικές και θεραπευτικές μέθοδοι σχετικές με την αγγειογένεση του διαφράγματος μπορεί να αναπτυχθούν με στόχο τον ταχύτερο και ασφαλέστερο απογαλακτισμό από τον μηχανικό αερισμό των ασθενών στις ΜΕΘ.
Εθνικό Κέντρο Τεκμηρίωσης και Ηλεκτρονικού Περιεχομένου (ΕΚΤ)
